Evaluación de la hipoxia tumoral: imágenes de oxígeno en 3D in vivo mediante resonancia paramagnética electrónica

Resumen

Se obtuvieron imágenes cuantitativas de mapas cuantitativos de oxígeno en 3D de tumores murinos de forma no invasiva mediante resonancia paramagnética de electrones de pulso. Para la anatomía y la estructura vascular se utilizaron el ultrasonido en modo B y el Doppler de potencia. Las imágenes de ambas modalidades se superpusieron para el análisis tumoral multiparamétrico.

Resumen

La medición precisa y en tiempo real de la presión parcial de oxígeno (_pO2) aporta información valiosa en muchas patologías, incluido el cáncer. La pO₂ baja del tumor (es decir, hipoxia) se relaciona con la agresividad del tumor y la mala respuesta al tratamiento. La cuantificación de la_pO2 tumoral permite evaluar la efectividad del tratamiento. La resonancia paramagnética electrónica (EPRI), en particular el EPRI de pulso, se ha convertido en un método tridimensional (3D) avanzado para evaluar la oxigenación de los tejidos in vivo. Esta innovación ha sido posible gracias a los desarrollos tecnológicos en EPR (Resonancia Paramagnética Electrónica) y a la aplicación de las sondas de espín oximétrico solubles en agua de la familia triarilo, que ofrecen datos de oxigenación rápidos y sensibles. El tiempo de relajación de la sonda de espín (T1 y/o T2) proporciona información precisa sobre_pO2 en vóxeles seleccionados.

Los tumores de glioblastoma humano LN229 se cultivaron en la almohadilla de moda interescapular de ratones desnudos BALB/c. Se utilizaron imágenes ecográficas (US) como referencia para la información anatómica del tumor. Para obtener imágenes de tejido pO₂, los animales se colocaron en una posición fija en el lecho del animal con fiduciales, lo que permitió el registro entre las modalidades de imagen. Después de la administración del agente de contraste OX071, se realizó EPRI, seguido de un modo B de EE. UU. Debido a la baja toxicidad de la sonda de espín, el procedimiento se puede repetir durante el crecimiento o el tratamiento del tumor. Después de la imagen, el proceso de registro se llevó a cabo utilizando software escrito en MATLAB. En última instancia, se puede calcular la fracción hipóxica para un tumor específico y se puede comparar el histograma de la distribución tisular de_pO2 a lo largo del tiempo. El EPRI combinado con el ultrasonido es una excelente herramienta para el mapeo de oxígeno de tumores en el entorno preclínico.

Introducción

La comprensión del microambiente tumoral (TME), con sus complejas interacciones espaciales y dinámicas, aporta una comprensión más completa de la biología tumoral. La hipoxia, o niveles bajos de oxígeno, es el componente clave de la EMT y desempeña un papel fundamental en el desarrollo de otras afecciones potencialmente mortales, como enfermedades cardiovasculares, trastornos metabólicos como la diabetes y enfermedad renal crónica ^1,2,3. La oxigenación de los tejidos es un factor fundamental, especialmente en el contexto del cáncer, donde la presión parcial de oxígeno en los tejidos (_pO2) se correlaciona con la resistencia a la terapia. Un nivel de_pO2 superior a 10 mm Hg se asocia con un aumento de la eficacia de la radioterapia de baja transferencia de energía lineal (LET) (efecto de mejora del oxígeno).

Estudios recientes en los que se ha realizado la Resonancia Paramagnética Electrónica (EPRI) han demostrado que la radioterapia guiada por oxígeno puede duplicar las tasas de supervivencia en diferentes cánceres en modelos murinos ^4,5. Esto es similar a los sujetos humanos cuyo tumor pO₂ se midió con múltiples mediciones de electrodos Eppendorf y se encontró que tenía valores medios o medios de pO₂ por debajo de 10 o⁶. Además de la radioterapia, la hipoxia tumoral se ha correlacionado directamente con la agresividad tumoral y el resultado de otras terapias, como la inmunoterapia ^7,8. Esta asociación subraya la importancia de las mediciones precisas de oxígeno para mejorar los resultados terapéuticos y comprender la fisiopatología de las enfermedades.

La oximetría in vivo óptima requiere una medición directa de la presión parcial de oxígeno en los tejidos, independientemente de factores como la perfusión tisular y la saturación de hemoglobina. El procedimiento debe ser no invasivo, con un tiempo de imagen breve y preciso para evitar posibles impactos en el organismo, como anestesia prolongada, alteraciones en la temperatura de los tejidos o cambios significativos en la presión y el pH de los tejidos. La oximetría tisular debe exhibir una alta precisión y confiabilidad, asegurando mediciones consistentes independientemente de las variaciones en el microambiente tisular, incluidas las diferencias en el pH y el estado redox. Para una planificación eficaz de la terapia, la reconstrucción de datos de imágenes en tiempo real y la interpretación sencilla son cruciales. Esto implica no solo lograr una resolución espacial preferiblemente inferior a 1 mm, sino también permitir una rápida recopilación de datos para monitorear los cambios dinámicos en el estado de oxígeno de los tejidos, como la hipoxia cíclica.

En este contexto, se han desarrollado varias técnicas para medir el oxígeno molecular o evaluar la hipoxia, cada una con una aplicabilidad y ventajas únicas. El electrodo de platino, considerado el "estándar de oro" para la oximetría de tejidos celulares y animales vivos, ofrece mediciones consistentes a través de una inserción precisa en los tejidos. Otros enfoques, como los métodos ópticos que utilizan sondas fluorescentes, la fotoacústica, el seguimiento de los efectos de la hipoxia a través de la expresión de genes o proteínas, o los ensayos de cometas, son fáciles de usar, pero son indirectos o están limitados por la trayectoria óptica en los tejidos. Las alternativas prometedoras para evaluar la hipoxia y/o la oxigenación parecen ser la resonancia magnética (RMN)-OE-RMN¹⁰ -- o MOBILE¹¹, la tomografía por emisión de positrones (PET) con varias sondas sensibles a la hipoxia¹², o la resonancia paramagnética electrónica (EPR).

La RAP tiene una larga trayectoria en el campo de la biomedicina. El fenómeno en sí fue reportado por primera vez en 1944 y fue ampliamente adoptado como una herramienta para el análisis de estructuras químicas y, más recientemente, para sistemas biológicos y materiales con electrones desapareados¹³. La espectroscopia EPR se ha utilizado para estudiar la dinámica y estructura de sistemas biológicos como la fotosíntesis, las metaloproteínas, las enzimas radicales y las membranas de fosfolípidos 14,15,16. La espectroscopia y la tomografía de resonancia paramagnética electrónica (EPR) han surgido como métodos no invasivos fundamentales para estudiar la oxigenación tumoral y el microambiente con una resolución espacial de ~ 1 mm, una resolución temporal de 1-10 min y una resolución de_pO2 de 1-3 torr ^5,17,18.

Los métodos EPR de onda continua (CW) siguen siendo ampliamente utilizados en la mayoría de las aplicaciones debido a la simplicidad de registro e interpretación de los espectros. Las interacciones de la sonda de espín de oxígeno funcionan evaluando las alteraciones en la intensidad de la señal EPR o la forma de la línea, proporcionando información sobre los niveles de oxígeno dentro de la muestra. CW EPR tiene una ventaja notable en la sensibilidad a un rango más amplio de_pO2 en comparación con los métodos de pulso. Mediante la aplicación de varias secuencias de pulsos, se puede dilucidar información como los tiempos de relajación del espín-espín de los electrones, los tiempos de relajación del espín-red y las interacciones con los espines vecinos^18,19. Las técnicas de EPR de pulsos, como la recuperación de inversión con lectura de eco de espín electrónico (IRESE), miden las tasas de relajación de la red de espín, evitando la relajación del artefacto causada por la relajación de la sonda de espín a bajas concentraciones de oxígeno^19,20. La EPR se puede utilizar para monitorear los cambios en la concentración de oxígeno con alta resolución temporal y espacial; sin embargo, en oximetría a altas concentraciones de oxígeno, el pulso EPR enfrenta limitaciones debido a los cortos tiempos de relajación de la magnetización transversal medidos con eco de espín electrónico (ESE). En última instancia, CW y EPR de pulso son complementarios, y una comprensión confiable del sistema de espín requiere la aplicación de ambos métodos.

Las técnicas de oximetría EPR se basan en la relación lineal entre los niveles de oxígeno y la red de espín, así como en las tasas de relajación de espín-espín en la solución. Todas las sondas oximétricas a menudo se dividen en dos tipos: sondas de espín solubles y de partículas. La elección de la sonda de espín correcta depende de la configuración experimental y de la información necesaria 21,22,23. Las sondas de espín solubles, como los nitroóxidos o los derivados de tritilo ^24,25 como OX063 y su forma deuterada OX071, distribuidas por todo el tejido, proporcionan información de todo el volumen. Alternativamente, para la medición de un solo punto y para evaluaciones de oxígeno prolongadas y recurrentes, se pueden utilizar sondas de estado sólido como LiPc, LiBuO o derivados de carbono (ver Tabla 1)22,23,26.

La ecografía en modo B se utiliza ampliamente en la clínica para la obtención de imágenes de tejidos blandos. La resolución depende de la frecuencia del transductor utilizada, y para estudios preclínicos, 18 MHz y superior proporcionan suficiente resolución en el plano y la profundidad de la imagen. Una ventaja adicional de la ecografía es la posibilidad de obtener imágenes de la vasculatura funcional utilizando el modo Power Doppler. Aquí, presentamos imágenes de oxígeno por resonancia paramagnética electrónica (EPROI) como un método para generar mapas de oxígeno en 3D de tumores en ratones vivos. La ecografía correspondiente permite la referencia anatómica necesaria para la definición del tumor dentro de EPROI. Es posible realizar varias sesiones de diagnóstico por imágenes para cada animal. El último paso es el análisis, que incluye la reconstrucción de la imagen y el registro entre las modalidades para obtener un histograma de_pO2 a partir del volumen tumoral.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Los ratones se obtuvieron de un centro de cría de animales aprobado y todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas éticas (en nuestro caso, Permiso n.º 165/2023, Primer Comité de Ética Local, Cracovia, Polonia).

1. Animales y línea tumoral

NOTA: Los ratones se alojaron en condiciones estándar de laboratorio: Claro/oscuro: 12 h/12 h, humedad: 60%, temperatura: 23 °C. Se les proporcionó una dieta estándar de comida con acceso gratuito a agua potable en jaulas comunitarias.

1. Cultivo de línea celular de glioblastoma multiforme murino LN229
   1. Cultivo de células LN229 en matraces de cultivo de^tejidos de 25 cm2 en medio DMEM suplementados con suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 10% y penicilina-estreptomicina a concentraciones de 10 U/mL y 0,1 mg/mL, respectivamente.
   2. Mantener las células en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO₂ a 37 °C, pasando cada 48 h utilizando tripsina-EDTA al 0,25% y PBS sin iones de magnesio y calcio (pH 7,4).
2. Inoculación de tumores
   1. Una semana antes de la inoculación, manipule diariamente a los ratones para que se familiaricen con el investigador.
   2. El día de la inoculación, pesar los ratones.
   3. Suspender 200.000 células LN229 en 50 μL de matriz extracelular sin factores de crecimiento. Con una aguja de 29 G, inocule la mezcla de células por vía subcutánea en la almohadilla de grasa intraescapular de ratones desnudos BALB/c de 16 semanas de edad (N = 5).

2. Imágenes Doppler US

En la figura 1 se muestra la cronología general de las imágenes tumorales. La ecografía se utiliza tanto para la obtención de imágenes de vasculatura por Doppler US como para la ecografía de anatomía como referencia justo antes de EPROI (Figura 2). La imagen anatómica en modo B es esencial para el análisis de la oxigenación tumoral mediante EPR y se describe en la sección 3. Si bien la ecografía Doppler (sección 2) no es obligatoria para el éxito del registro, proporciona información valiosa sobre la ventana de tiempo óptima para el estudio EPR y permite determinar la vasculatura activa en el área tumoral.

1. Preparación del ratón
   1. Esperar hasta que los tumores alcancen alrededor de 30 mm³. Si es necesario, afeita los ratones manualmente alrededor del sitio del tumor.
   2. Inducir la anestesia con isoflurano al 2% y mantenerla con isoflurano al 1-1,5%.
   3. Transfiera al animal de la cámara de anestesia a una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal a 37 °C durante la preparación (según la sonda de temperatura rectal). Estabilizar la temperatura del animal para obtener una adecuada retroalimentación de los parámetros fisiológicos.
2. Sonografía
   1. Utilice el sistema de ultrasonido con un transductor de 57-25 MHz para la obtención de imágenes preclínicas (Figura 2, paso 1).
   2. Adquiera mediciones 3D en modo B para la visualización de la morfología tumoral en dirección sagital. Utilice un tamaño de paso de 0,1 mm.
      NOTA: No mueva el animal ni el transductor para conservar exactamente los mismos ajustes.
   3. Emplee el modo Doppler de potencia para visualizar la vasculatura tumoral funcional con los siguientes parámetros: Velocidad: 1,5 kHz, Filtro de pared: Baja, Prioridad: 75%, Persistencia: Media, Tamaño de paso 0,10 mm.
   4. Gire el transductor para repetir los pasos 2.2.2 y 2.2.3 en dirección axial.
   5. Realice el análisis de datos con el software proporcionado por el fabricante del ultrasonido. Marque el borde del tumor, cárguelo en una imagen 3D y calcule el volumen del tumor y el porcentaje de vasculatura.

3. EPROI

1. Preparación de la sonda
   1. Disuelva el polvo de OX071 almacenado a -80 °C en H₂O inyectable hasta una concentración final de 1 g/10 mL (~70 mM).
2. Preparación del ratón
   1. Anestesiar a los ratones con isoflurano al 1%-3% mezclado con el aire de la habitación y colocarlos en un soporte para animales.
   2. Administrar 1 mL de suero fisiológico por vía subcutánea para mantener el nivel de hidratación adecuado.
   3. Controle la frecuencia respiratoria (80 ± 20 latidos por minuto) y la temperatura (37 ± 1 °C) del animal utilizando un sensor de almohada respiratoria y un termómetro de superficie conectado a la piel del ratón. Controle la temperatura rectal como punto de referencia (37 °C ± 1 °C).
   4. Inserte un tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) (0,7 mm de diámetro externo) intraperitoneal para la administración de la sonda de centrifugado. Asegure la cánula con el uso de vinilo polisiloxano (VPS) para evitar que se caiga de la cavidad abdominal.
   5. Inserte un catéter de orina (24 G) para recoger la sonda de centrifugado excretada.
   6. Asegure el ratón en una cama de animales con arcilla dental VPS para la inmovilización (Figura 2A).
3. Imágenes anatómicas de EE. UU. para registro
   1. Encienda la mesa controlada en 3D y la cama nivelada. Ajuste la temperatura de la plataforma a 60 °C para que la temperatura del animal aislado por el soporte de cama de plástico se mantenga a 37 °C.
   2. Coloque la cama con el animal inmovilizado en el soporte de cama y transfiérala a una mesa controlada en 3D para obtener imágenes anatómicas antes de la medición de EPR (Figura 2B). Asegúrese de que el animal esté asegurado dentro del soporte de la cama y no toque la plataforma de calefacción.
   3. Fije la posición del soporte de la cama en tres dimensiones para evitar la rotación, particularmente la rotación XZ (plano sagital), que es crucial para un registro preciso.
   4. Coloque un marcador de posición (alambre de pescar en la cinta, de 0,35 mm de diámetro) en el soporte de la cama, marcando el comienzo del resonador.
   5. Realice imágenes en modo B manualmente con un paso de 1 mm en las direcciones axial y sagital hacia el eje Y.
   6. Obtener imágenes de la estructura tumoral con los siguientes parámetros en función de la frecuencia específica del transductor; para un transductor de 18 MHz, profundidad 20 mm, rango dinámico 84 dB, potencia 8 dB, ganancia 80%; para transductor de 40 MHz, profundidad 20 mm, rango dinámico 32 dB, ganancia 100%; para transductor de 57 MHz, profundidad 13 mm, ganancia 6 dB, potencia 100%. Ajuste la configuración del enfoque del transductor de acuerdo con la ubicación particular del tumor.
   7. Al final de las imágenes anatómicas, limpie el exceso de gel del ratón y retire el ratón inmovilizado en la cama del animal del soporte de la cama.
4. Imágenes de oxígeno EPR
   1. Utilice el generador de imágenes de oxígeno para Pulse EPR, que opera dentro de frecuencias de radio que van desde 685 MHz a 735 MHz. Para la configuración, emplee bobinas desplazadas para obtener imágenes en 3D y analizar los tiempos de relajación. Utilice un resonador horizontal de 32 mm x 35 m.
   2. Transfiera el ratón inmovilizado en la cama del animal rápidamente al generador de imágenes EPR después de la ecografía anatómica (Figura 2C). Mantenga la posición del lecho del animal con cuidado para minimizar las rotaciones dentro del resonador, de manera similar al procedimiento descrito en la sección 3.3.
   3. Vuelva a conectar la sonda de temperatura para garantizar el monitoreo y mantenimiento continuos de la temperatura del animal, correlacionándola con la temperatura dentro del resonador.
   4. En el software del espectrómetro EPR, realice la sintonización del resonador utilizando la rueda de sintonización para centrar la frecuencia alrededor de 725 MHz (Figura 3A).
      NOTA: Un resonador bien adaptado debe tener una caída de 25 dB o mejor.
   5. Optimice la potencia de microondas para obtener un pico a 60 ns (Figura 3B) ajustando el valor de atenuación de 20 dB a 3 dB.
   6. Ajuste el instrumento para que la desintegración por inducción libre (FID) de los fiduciales colocados dentro del lecho del animal se centre en el campo magnético y se desfase (Figura 3C).
   7. Administrar 100 μL de OXO71 por vía intraperitoneal a través de la cánula previamente insertada, seguido de un lavado con 50-100 μL de solución salina.
   8. Utilizando una secuencia de cola programada, adquiera mediciones con parámetros establecidos; una secuencia típica contiene tiempos de relajación T1, T2, eco de espín electrónico 3D (ESE) para imágenes de referencia y eco de espín de electrones de recuperación de inversión 4D (IRESE) para la imagen animal. Recoja las imágenes IRESE con un gradiente de 1,5 G/cm, tiempo de repetición de 55 μs, predisparo de -250 ns, t90 es de 60 ns y tau 400 ns; Tiempo total de adquisición ~12 min. Repita la toma de imágenes de IRESE al menos durante 30-40 minutos (3-4x) después de la inyección de la sonda.
   9. Después de la toma de imágenes, transfiera el ratón de la cama del animal a la almohadilla térmica. Administrar 1 mL de suero fisiológico por vía subcutánea para mantener el nivel de hidratación adecuado. Vigile hasta que el ratón recupere la locomoción vertical.

4. Análisis de datos

1. Análisis de reconstrucción 4D en "ProcessGUI"
   1. Antes de la reconstrucción, aplique la corrección de línea base en las proyecciones seleccionando el escenario "PulseRecon.scn" y cargando el archivo de parámetros "IRESE_64pts_mouse_STANDARD_CHIRALITY.par" para analizar los datos sin procesar de IRESE.
   2. Filtre cada proyección con un filtro gaussiano de una anchura de 4 puntos, una configuración predeterminada para el escenario seleccionado.
   3. Submuestrear las proyecciones filtradas a 64 puntos (tamaño de matriz), una configuración predeterminada para el escenario seleccionado.
   4. Filtre aún más las proyecciones con un filtro de Ram-Lak con apodización a 0,6 veces la frecuencia de Nyquist (haga clic en Parámetro de reconstrucción | FilterCutOff).
   5. Proyecte las proyecciones filtradas para producir una imagen espectral-espacial 4D.
   6. Utilice un algoritmo de ajuste para extraer el ancho de línea del paquete de espín del espectro en cada vóxel. Configuración de los parámetros de ajuste de la sección: Extensor de último punto - 3, método de ajuste - predeterminado.
   7. Utilice la configuración predeterminada para los parámetros en el procedimiento de ajuste, incluida la amplitud del espectro, la fase, el centro espectral y el ancho de línea del paquete de espín espectral.
2. Registro entre la ecografía anatómica y EPROI en "ArbuzGUI" (Figura 4)
   NOTA: Para realizar el registro se utilizó el procedimiento MATLAB "ArbuzGUI" desarrollado por Boris Epel de la Universidad de Chicago. El software está disponible en EPR-IT https://github.com/o2mdev/eprit. La caja de herramientas de registro se explicó anteriormente en otro lugar²⁷. Consulte el manual del usuario para obtener instrucciones detalladas paso a paso²⁸.
   1. Cargue imágenes 2D US como una pila con un paso de 1 mm (el paso está estrictamente relacionado con la adquisición de fotogramas en imágenes en modo B, punto 3.3.7) para crear imágenes 3D US .
   2. Agregue las imágenes de pO2 recopiladas (reconstruidas en el paso 4.1) como tipo de imagen 3D establecido como datos "PO2_pEPRI". Almacenar datos en el proyecto.
   3. Para crear una secuencia de registro y una transformación, seleccione Especial | Registro MRI-EPRI.
   4. Seleccione la imagen que debe ajustarse a los datos EPRI (por ejemplo, 3D axial de EE. UU.) seleccionando Secuencia | agregar acción. Utilice la etapa 5:T2 para obtener el mejor rendimiento. En el resultado, aparecerá un símbolo más negro delante del nombre de la imagen seleccionada.
   5. Abra la imagen de EE. UU. en SliceMaskEditPLG. Ajuste la escala de la imagen de EE. UU. en función de la regla que se presenta en las imágenes. Marque el marcador de posición de EE. UU., el contorno del animal y la posición del tumor en función de los fotogramas seleccionados.
   6. En SliceMaskEditPLG, marque el contorno del mapa pO₂ y el fiducial en las imágenes 4D pO₂ reconstruidas.
   7. Con el visor de figuras y la caja de herramientas RotateImagePLG, gire la imagen de EE. UU. de acuerdo con el marcador de posición de EE. UU. frente a las posiciones de referencia para registrar el mapa pO₂ con el contorno de EE. UU.
   8. Transforme la máscara tumoral de la imagen de EE. UU. al mapa pO₂ .
   9. Visualice la máscara tumoral en el mapa pO₂ del ratón y exporte los valores de pO₂ para cada vóxel.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

En la Figura 5 se muestra una sección transversal representativa de la imagen ecográfica de un tumor LN229 que crece en la almohadilla de grasa intraescapular, junto con la vasculatura. Se observa algo de vasculatura fuera del borde del tumor. Inesperadamente, el porcentaje del volumen de la vasculatura tumoral no disminuyó y se mantuvo estable con el crecimiento tumoral.

Como se describe en la Figura 2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Hay algunos pasos críticos en el protocolo de imágenes descrito. En primer lugar, para registrar las imágenes de la anatomía con los mapas de oxígeno, la resonancia magnética podría ser una mejor opción que la ecografía debido a su mejor resolución y a la capacidad de proporcionar datos detallados en 3D¹⁹. La ecografía con un transductor de alta frecuencia proporciona una excelente resolución y una profundidad de imagen suficiente para los estudios pre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
aqua pro injectione	Polpharma	1280610	-
ArbuzGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
disodium phosphate	POCH S.A.	799280115	-
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose	Merck Life Science	D5648	4500 mg/L glucose and L-glutamine
fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10500064	-
fishing wire	Good Fish	A-55A-035	US position marker - 0.35 mm
Geltrex	Gibco, Thermo Fisher Scientific	A1413302	reduced growth factor basement membrane matrix
ibGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
injectio natrii chlorati isotonica	Polpharma	multipe items were used	9 mg/mL
insulin needles 29 G	Becton, Dickinson and Company	multipe items were used	-
Jiva 25	O2M Technologies	-	EPROI
MATLAB	MathWorks	-	version R2021b
penicillin-streptomycin	Merck Life Science	P4333	with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
potassium chloride	POCH S.A.	739740114	-
potassium dihydrogen phosphate	POCH S.A.	742020112	-
ProcessGUI	O2M Technologies	-	accesible in the github repository
PTFE tubing	Cole Palmer Instrument Co	06412-11	-
sodium chloride	POCH S.A.	794121116	-
SpecMan4EPR	FEMI Instruments	-	version 3.4 CS 64bit
Surflash I.V. Catheter	Terumo	SR*FF2419	size: 24G x ¾"
tape	3M	multipe items were used	micropore
Trypsin-EDTA	Gibco, Thermo Fisher Scientific	25200072	-
Ultrasonography	Telemed	-	Anatomical US
US gel	KONIX	NUG-0019	-
Vetflurane	Virbac	137317	1000 mg/g
Vevo F2	FujiFilms, Visual Sonics	-	B-mode and Doppler
vinyl polysiloxane dental clay	3M ESPE	multiple items were used	-