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  • 参考文献
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摘要

这里使用的实验展示了一种分子对接结合探针技术的方法，以预测和验证中药小分子与蛋白质靶点之间的相互作用。

摘要

去泛素化酶 （DUB） 在调节泛素化稳态中起着关键作用，UCHL3 是一种典型的半胱氨酸 DUB，错综复杂地参与无数的生理和病理过程。因此，开发靶向泛素 C 末端水解酶 L3 （UCHL3） 的小分子抑制剂具有重要意义。该方案旨在建立以 UCHL3 为代表的半胱氨酸 DUB 小分子抑制剂的虚拟筛选和 体外 验证过程。首先，使用分子对接技术对 UCHL3 的潜在抑制剂进行虚拟筛选，并将药物与蛋白质靶点之间的相互作用可视化。随后，通过 体外 活性抑制试验验证筛选药物丹参素的有效性。泛素-7-氨基-4-甲基香豆素 （Ub-AMC） 和血凝素-泛素-乙烯基砜 （HA-Ub-VS） 用作 体外 活性测试的探针，因为它们可以与带有小分子抑制剂的 DUB 竞争性结合以评估 UCHL3 的活性。结果表明，丹参素在分子对接中与 UCHL3 具有良好的结合亲和力，它可以竞争性地抑制 UCHL3 与 HA-Ub-VS 的活性。这些发现为进一步研究和开发靶向 UCHL3 的治疗药物提供了重要参考。

引言

泛素化是蛋白质的翻译后修饰，E1 泛素激活酶、E2 泛素结合酶和 E3 泛素连接酶将泛素连接到靶蛋白上，泛素化的整个过程可以通过去泛素化酶 （DUB） 逆转1,2,3,4。由于其重要的生理和病理作用，DUB 被认为是药物发现的重要靶标 5,6。

已在人类中鉴定出 100 多种 DUB 7,8。它们通常作为异肽酶发挥作用，负责裂解泛素的 C 端与底物或其他泛素分子中的赖氨酸残基之间的异肽键 9,10。目前，它们主要分为七大科，即：泛素特异性肽酶 （USP）、卵巢肿瘤蛋白酶 （OTU）、Jab1/Mov34/Mpr1 Pad 1 N 端 + 结构域蛋白酶 （JAMM）、与含泛素的新型 DUB 家族蛋白酶相互作用的基序 （MINDY）、泛素 C 端羟化酶 （UCH）、Machado-Josephin 结构域蛋白酶 （MJD） 和含锌指泛素肽酶 1 （ZUP1）9.除了属于锌金属蛋白酶家族11 的 JAMM 之外，其他 DUB 是半胱氨酸蛋白酶，其特征是由催化半胱氨酸、组氨酸和第三个酸性残基组成的催化三联体12,13。这种特异性为开发靶向酶活性位点或附近变构口袋的小分子抑制剂开辟了途径。

在去泛素化酶研究领域，表征其活性存在重大挑战14,15。基于活性探针的表征是研究 DUB 抑制剂的重要方法16。通过在细胞裂解物或重组蛋白中使用基于活性的探针和抑制剂进行竞争性测定，可以表征 DUB 的活性，从而促进靶向这些酶的小分子抑制剂的开发。Ub-AMC 是一种用于检测 DUB 活性的早期探针，其荧光基团连接到泛素的 C 端17,18。当 DUBs 发挥催化活性时，AMC 被大量释放，其检测到的光的荧光强度也相应增强。该探针已广泛用于 DUB 抑制剂的高通量筛选19,20。HA-Ub-VS 探针也用于测量 DUB 活性21。它在泛素的 C 端有一个乙烯基砜基团，使其成为 DUB 的自杀性底物。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 分离后，可以使用蛋白质印迹法检测活性 DUB 22,23,24。

传统中医 （TCM） 使用药用植物已有 2000 多年的历史。从天然产物中开发新药具有重要的医学意义，重点是识别活性成分并阐明其机制25。 丹参 Bge 是一种广泛用于治疗多种疾病的草药，包括癌症、心血管、肝脏和神经系统26。目前，它包含已知的小分子，如丹参酮27、丹参素28、丹参酸29 等。这些化合物表现出多种生物活性，例如抗血栓形成、抗氧化和抗肿瘤作用，使其对研究非常有价值26。最近的研究确定丹参素是 SARS-CoV-230 的 3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶 （3CLpro） 的共价抑制剂。已显示它与 3CLpro 的活性位点残基 C145 形成共价键，表明 丹参 中存在潜在的小分子蛋白酶抑制剂。

泛素 C 末端水解酶 L3 （UCHL3） 属于 DUB 的 UCH 家族中的半胱氨酸蛋白酶。它依靠半胱氨酸95、组氨酸169 和天冬氨酸184 等保守残基来有效催化其功能31,32。它在多种分子途径中起着至关重要的作用，包括细胞周期、同源重组和蛋白质连接 DNA 断裂的修复33。此外，它在卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌等各种癌症中上调34。基于这些研究，UCHL3 似乎是治疗疾病的一个有前途的靶点。已经确定了几种 UCHL3 小分子抑制剂，并正在走向临床使用35,36。

在这项研究中，进行了分子对接以研究 Salvia miltiorrhiza Bge 和 UCHL3 小分子之间的相互作用。随后，使用 DUB 特异性探针 Ub-AMC 和 HA-Ub-VS 的 体外 实验确定丹参素是 UCHL3 的小分子抑制剂。分子对接还预测了丹参素的潜在结合位点，提示其作用机制。

研究方案

1. 下载 丹参 小分子结构 Bge 和 UCHL3

  1. 下载小分子文件。
    1. 打开 TCMSP 数据库 （https://old.tcmsp-e.com），输入丹参 （草本名称），然后按 搜索 并单击结果列表中的 Radix Salviae 。
    2. 单击 逐个下载 项目并以 .mol2 格式 保存 2D 结构。
  2. 下载 protein 文件。
    1. 打开 PDB 数据库 （https://www.rcsb.org/），输入 UCHL3，然后按 搜索。单击 Homo sapiens， 然后按 refinements 中的 search 。
    2. 选择具有小分子-蛋白质共结晶的结构 1XD3 ，然后单击 下载 文件并选择 PDB 格式。

2. 分子对接

  1. 保存文件。
    1. 在桌面上创建一个名为 danshen_UCHL3 的新文件夹，并将 Salvia miltiorrhiza Bge 和 UCHL3 结构的化合物保存在此文件夹中。用英文命名文件夹;否则，文件导入失败。
  2. 设置路径。
    1. 打开 Maestro 软件，单击 “文件”，选择 “更改工作目录”，单击 “桌面”，双击以选择 danshen_CUHL3停靠文件夹，然后单击 “选择选项”。
  3. 小分子加工
    1. 导入小分子结构。
      1. 单击 File 和 Import Structures 选项。单击 Desktop，双击 停靠文件夹，然后单击 Salvia miltiorrhiza Bge 结构 文件。然后，单击 Open 导入所有小分子。
    2. 准备小分子。
      1. 单击 Tasks 并选择 LigPrep 选项。在显示的 LigPrep 窗口中，单击 Use structure from 选项上的项目表，选中 computation 下的 Determine chiralities from 3D structure 选项，并将所有其他软件设置保留为默认值。
      2. 将作业名称更改为 danshen_ligprep1，然后单击 Run 以执行小分子处理。
  4. 蛋白质结构加工
    1. 导入蛋白质结构。
      1. 点击 File 和 Import Structures 选项，点击 Desktop 并双击 danshen_CUHL3 停靠 文件夹。
      2. 单击 UCHL3 蛋白质结构 文件，然后单击 Open（打开 ）以导入蛋白质结构文件。
    2. 准备蛋白质。
      1. 选择连接 UCHL3 和小分子的两个共价键，然后使用 Delete 按钮删除它们。然后，选择删除后不完整的两个蛋白质残基。单击 Build 按钮，选择 Other edits，然后对于 Gly75 单击 C 按钮，对于 Cys95 选择 Mutate Residue 和 CYS。
      2. 单击 Tasks 并选择 Protein Preparation Workflow 选项。将所有其他软件设置保留为默认值。将作业名称更改为 UCHL3_protein pre，然后单击 Run（运行 ）以执行蛋白质处理。
    3. 设置扩展坞盒。
      1. 单击 Tasks，选择 Receptor Grid Generation，然后选择 Pick 以识别配体 分子。在 workspac e 中选择小分子，会出现一个以小分子坐标为中心的粉红色停靠框。
      2. 保留默认设置，将作业命名为 1XD3_danshen_glide_grid，然后单击 Run （运行）。
        注意：在 1XD3 中，小分子与蛋白质形成共价键。有必要去除这个共价键以将小分子与蛋白质分离。否则，在受体网格设置过程中，无法选择小分子。
  5. 进行分子对接。
    1. 单击 Tasks 并选择 Ligand Docking 选项。选择 Receptor Grid， 单击 From file，然后单击 Browse。选择 1XD3_danshen_glide_grid.zip 文件，然后单击 Open（打开）。
    2. 单击 Use Ligands from as files（使用配体作为文件），然后单击 Browse（浏览）。单击 danshen_ligprep1 文件，选择 danshen_ligprep1-out. maegz 文件，然后单击 Open。
    3. 单击 设置 并选择 精度 作为 SP 选项，将作业名称更改为 danshen_UCHL3_ glidedock _SP，然后单击 运行。
  6. 查看停靠结果。
    1. 单击 File 和 Import Structures 选项。单击 Desktop 并双击 danshen_CUHL3 停靠文件夹。
    2. 双击 danshen_UCHL3_ glidedock _SP 文件，单击 danshen_UCHL3_ glidedock _SP_pv.maegz 文件，然后单击 Open（打开）。
    3. 单击 Table （表 ） 选项，然后在 docking score （停靠分数） 下查看分数。
  7. 可视化 danshensu 和 UCHL3 交互。
    1. 双击 danshen_UCHL3_glidedock _SP_pv.maegz 文件， 然后在 Maestro 中打开它。在条目列表中，按住 Shift 键并同时选择 danshensu 和蛋白质。
    2. 右键单击并选择 Merge 以创建新 结构。选择 新结构，右键单击，选择 “导出”，然后单击 “结构”，将文件命名为 danshensu_UCHL3，并将其 导出为 .pdb 格式。
    3. 在面板中选择 合并结构 ，点击 任务，选择 2D 草绘器，得到 danshensu 和 UCHL3 交互的 2D 结构图。
    4. 将 danshensu_UCHL3.pdb 文件导入 pymol 软件，并根据从 Maestro 获得的 2D 结构进行可视化。

3. 纯化蛋白 UCHL3

  1. pHUE-UCHL3 原核表达质粒的构建
    1. 从 NCBI （isform2） 获取重组蛋白 UCHL3 基因的编码序列。通过同源重组将获得的基因片段整合到 pHUE-10HIS 载体中，并将其转化到 DH5α 感受态细胞中。提取质粒 DNA 以获得所需的构建体。
  2. 重组蛋白的诱导和纯化
    1. 细菌培养：
      1. 将重组质粒转化到 BL21 （DE3） 感受态细胞中，并将它们铺展在含有氨苄青霉素的 Luria-Bertani （LB） 琼脂平板上。将板在 37 °C 下孵育过夜。
      2. 挑取单个菌落，将它们接种到 12 mL 补充有 50 μg/mL 氨苄青霉素的液体 LB 培养基中，并在 37 °C 下培养过夜。
    2. 转化和归纳
      1. 使用新鲜培养基将过夜细菌培养物稀释至 2%。当 OD 600 达到 0.4-0.6 时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 至终浓度为 0.4 mM，在 16 °C 下低温诱导 12 小时。
    3. 收集细菌培养物
      1. 将细菌培养物转移到无菌离心管中，并以 2200 x g 离心 10 分钟。去除上清液并将菌株储存在 -80 °C 以保存。
    4. 超声处理
      1. 将菌株重悬于 25 mL（收集的细菌培养物的 1/20）缓冲液 1（50 mM HEPES pH 7.5、200 mM NaCl、1 mM EDTA）中。在以下条件下进行细菌超声处理：开启 4 秒，关闭 6 秒，能量设置为 60%，持续 15 分钟。加入 1% Triton X-100 并在 4 °C 下裂解 30-60 分钟。
    5. 分离上清液和沉淀
      1. 将样品在 4 °C 下以 9000 x g 离心 30 分钟。收集上清液并通过 0.45 μm 膜过滤器过滤。保留 50 μL 上清液作为输入。
      2. 将沉淀重悬于缓冲液 1 中，加入适量的 5x 样品缓冲液（25% 1M Tris-HCl [pH 6.8]、10% 十二烷基硫酸钠、0.5% 溴酚蓝、41.67% 甘油和 10% DL-二硫苏糖醇），并在 100 °C 下煮沸 10 分钟。
  3. 蛋白纯化
    1. 色谱柱平衡
      1. 将 1 mL NiNTA 镍树脂加载到色谱柱中，使其沉降 10 分钟，然后依次用 5 倍柱体积的缓冲液 2（50 mM HEPES pH 7.5,50 mM NaCl）平衡色谱柱，其中含有 10 mM、500 mM 和 10 mM 咪唑。
      2. 使用移液管沿柱壁加入 5 mL（约 5 倍柱体积）的 10 mM 咪唑溶液。在不控制流速的情况下执行此过程。
      3. 一旦液体刚好覆盖填料并几乎排干，依次加入 5 倍柱体积的 500 mM 咪唑溶液和 10 mM 咪唑溶液以达到平衡。当剩余的 10 mM 咪唑溶液刚好覆盖填料时，关闭流量控制器以停止平衡。
    2. 蛋白纯化
      1. 将过滤后的蛋白质上清液以 0.5 mL/min（每滴 <15 秒）的流速通过色谱柱，收集流出馏分。使用缓冲液 2 和 0.5 M NaCl 制备 10 mM、30 mM、50 mM 和 100 mM 咪唑的浓度梯度。
      2. 从低浓度到高浓度咪唑依次洗脱，使用移液管沿柱壁添加约 5 倍柱体积的溶液，而不控制流速。将洗脱液收集在干净的 1.5 mL 微量离心管中，每管流过 1 mL。
      3. 收集 5 个试管后，从每个试管中取出 1 μL 流出液，与 1 μL Bradford 缓冲液反应。如果反应仍然是蓝色，请继续执行这些步骤;如果它变成透明，则停止该浓度的洗脱并切换到下一个浓度。
      4. 用 100 mM 咪唑洗脱后，用 10 倍柱体积的 0.5 M NaCl 洗涤，不要控制流速或收集洗脱液。
      5. 最后，用 500 mM 咪唑洗脱（每滴 <15 秒）。使用移液管向色谱柱中加入 1 mL 溶液，保持上述缓慢的洗脱速率。使用 1.5 mL 微量离心管收集 1 mL 洗脱液，并重复此过程 10 次。
    3. 使用考马斯亮蓝染色评估纯化的蛋白质。
      1. 从每组中取 10 μL 并加入适当的 5x 样品缓冲液，然后在 100 °C 下加热 5 分钟，定量先前获得的沉淀、预纯化上清液和收集的 10 个蛋白质管。
      2. 制备 1 mg/mL、500 μg/mL 和 100 μg/mL 的牛血清白蛋白 （BSA） 标准溶液。然后加入适当的 5x 样品缓冲液并在 100 °C 下加热 5 分钟。
      3. 对样品进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，然后取出凝胶并在室温 （RT） 下在考马斯亮蓝溶液中在低速摇床上孵育过夜。
      4. 第二天，将凝胶转移到脱色溶液（40% 乙醇、10% 乙酸、50% H2O）中进行脱色，根据需要轻轻加热。凝胶透明后，在显影仪器下观察，根据 BSA 水平定量纯化的蛋白质，并通过检查单个条带来评估纯度。
    4. 蛋白质储存：将蛋白质分装到微量离心管中，每管 50 μL，在液氮中快速冷冻，并在 -80 °C 下储存。

4. UCHL3 活性测定（Ub-AMC 测定）

  1. 蛋白质制备
    1. 在冰上解冻蛋白质，在 RT 下以 1000 x g 离心样品 3 分钟，并使用 BCA 方法测定蛋白质浓度。使用缓冲液 1 将蛋白质稀释至 40 nM 的浓度。
  2. 设置组
    1. 将缓冲液 1 指定为对照组，将 UCHL3 指定为实验组。在 96 孔板中每孔添加 200 μL 每个样品，每组设置 3 个重复。
  3. 检波
    1. 在测量前，将 Ub-AMC 快速加入每个孔中并剧烈摇晃 2-5 秒。使用的 Ub-AMC 浓度为 250 nM。在 37 °C 条件下测量 380 nm 激发波长和 460 nm 发射波长的 OD 值，每 30 秒获取一次读数，最长 10 分钟。

5. HA-Ub-VS 对 UCHL3 活性的抑制测定（HA-Ub-VS 测定）

  1. 蛋白质制备
    1. 在冰上解冻蛋白质，在 RT 下以 1000 x g 离心样品 3 分钟，并使用 BCA 方法测定蛋白质浓度。将蛋白质稀释至 10 μg/mL 的浓度。
  2. 小分子的制备
    1. 称量丹参素，并使用高纯水以梯度将其稀释至 5 mM、1 mM、100 μM、10 μM 和 1 μM。
  3. 设置组
    1. 将纯蛋白组和不含小分子药物的组设置为阴性对照组。以 PR619 （DUB 抑制剂） 为阳性对照组，其他组为小分子药物治疗组。
  4. 样品制备
    1. 根据分组，依次向每个药物治疗组添加相应浓度的 9 μL UCHL3 和 1 μL Dansensu。向阳性对照组添加 1 μL PR619（使用 50 μM）。使用高纯水和缓冲液 1 补足阴性对照组。
    2. 涡旋充分混合，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。将反应样品置于冰上，加入 HA-Ub-VS 至终浓度为 1 μM，涡旋充分混合，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
    3. 加入适量的 5x 样品缓冲液，并在 100 °C 金属浴中加热 10 分钟。将样品在 RT 下放置 5 分钟，然后上样到凝胶上。

6. 蛋白质印迹

  1. SDS-PAGE 凝胶的制备
    1. 用超纯水冲洗一组玻璃板。将板放入夹槽中，然后放在透明板上。加入超纯水并检查泄漏 10 分钟。
    2. 根据点胶台准备分离胶。
    3. 从凝胶盒中倒入高纯水，并用滤纸吸收剩余的水。快速均匀地加入准备好的 12% 分离凝胶。然后加入 1 mL 异丙醇，等待约 30 分钟，直到凝胶凝固。
    4. 根据点胶台准备顶层浓胶。
    5. 从分离凝胶顶部取出异丙醇，用高纯水洗涤 3 次，用滤纸吸干。快速加入准备好的 3% 浓缩凝胶，插入 1.0 mm 15 孔梳子，等待约 30 分钟。
      注意： 保持梳子垂直于胶水表面，并确保没有气泡出现。
  2. 电泳
    1. 垂直取下电泳梳，将足量的电泳缓冲液倒入电泳仪的内腔中，确保液体覆盖样品孔。
    2. 将蛋白质标记物和制备的实验样品置于室温下，彻底涡旋，并短暂离心。将 3 μL 蛋白质标志物加入到第一个左侧样品孔中，然后将 10 μL 实验样品加入到随后的每个孔中。
    3. 在电泳槽外腔中加入适量的电泳缓冲液，用盖子盖住电泳槽，并连接电源。确保电源连接正确。
    4. 打开电源，将电压设置为 80 V，直到样品浓缩成线，然后在分离凝胶中开始分离后，将电压增加到 120 V。
      注意： 在此过程中，请确保底部没有气泡。如果出现气泡，请将电泳仪向一侧倾斜以排出气泡。
  3. 转移到膜上
    1. 用塑料刀撬开凝胶盒。在左上角开始上样的地方切掉一个角，以标记方向。将凝胶和所需滤纸浸泡在转印缓冲液中 1-2 分钟。
    2. 根据目标蛋白所需的大小测量并切割聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜。通过将 PVDF 膜浸泡在甲醇中 20 秒至 1 分钟来激活 PVDF 膜，然后将其与凝胶一起浸入转印缓冲液中。
    3. 将少量转印缓冲液倒入转印装置中，用滚筒润湿半干转印装置。按以下顺序从下到上排列组件：三层滤纸、凝胶、PVDF 膜和另外三层滤纸。
    4. 放置每一层后，使用滚筒去除任何气泡。用转印缓冲液润湿盖子，然后盖上设备。
      注：确保存在足量的转印缓冲液，完成每层后添加少量。提前准备标记，区分上样的凝胶左右两侧，以及识别膜的正面和背面。放置每一层后，轻轻滚动以去除任何气泡。
    5. 打开电源，确保极性正确。将电流调整为 190 mA 并将时间设置为 45 分钟。
  4. 阻塞
    1. 在 TBST（1% Tween20）中制备 5% 脱脂奶粉溶液作为封闭缓冲液。将正面朝上的PVDF膜放入杂交盒中，倒入10 mL封闭缓冲液，然后在室温下在低速振荡器上轻轻摇动1小时以封闭。
  5. 一抗孵育
    1. 用抗体溶液 1 以 1：1000 的比例制备一抗，并向新的孵育盒中加入 10 mL 一抗。将孵育箱置于 4 °C 的冷藏室中，并在摇床上放置过夜。
  6. 二抗的孵育
    1. 第二天在孵育盒中收集一抗，然后加入适当的 TBST 溶液，放在摇床上洗涤 5 分钟，重复 3 次。
    2. 用 5% 牛奶溶液以 1：5000 的比例制备二抗。将 1 mL 二抗滴到湿润的杂交盒底部。将蛋白质面朝下的 PVDF 膜放在二抗上，然后在 RT 下在低速振荡器上孵育 1.5 小时。
    3. 加入适当的 TBST 溶液，将其放在摇床上洗涤 5 分钟;重复 3 次。
  7. 露出条带
    1. 取等体积的化学发光试剂 A 和 B，摇匀并充分混合。将溶液遮光。
    2. 将显影液均匀地涂在 PVDF 膜上，轻轻摇晃以确保膜均匀地涂有溶液。
    3. 将膜放入凝胶成像系统中，并设置曝光时间、曝光次数和其他相关参数。
      注意：开发者必须完全遮盖条带，开发应在黑暗的环境中进行。

结果

为了筛选出 丹参 中能有效抑制 UCHL3 的小分子，我们从 TCMSP 网站获得的小分子与 UCHL3 进行了分子对接。对接结果排名前 30 位的小分子及其得分如 表 1 所示。所有小分子的对接结果见 补充表 1。我们选择丹参素作为代表性小分子进行研究。如图 1 所示，丹参素和 UCHL3 分别与 ARG-186、HIS-169、VAL-166 和 ASN-93 具有氢键，?...

讨论

DUB 通过从底物或聚泛素链中去除泛素，在调节整个泛素系统的稳态中起着至关重要的作用37。近年来，这些酶作为药物开发的目标也引起了广泛关注13。然而，小分子药物开发过程中存在挑战。例如，涉及数以万计的小分子文库的高通量筛选会导致高成本和巨大的工作量负担38。中医具有数千年的临床使用历史和扎实?...

披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了北京国家自然科学基金 [资助号 7244498] 的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
30% AcrylamideBeijing Lablead Biotech Co., LtdA3291
Ammonium persulfateChina National Medicines Corporation Ltd10002616
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074Cell Signaling Technology7074P2
BeyoECL PlusBeyotimeP0018S
Bradford Protein Assay KitBeyotimeP0006
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115-01
DanshensuShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB20254
DMSOAmeresco, Inc.21K2356571
Electrophoresis SystemLiuyi Biotechnology112-0630
HEPESSigmaH3375
His-tagged protein purification kit (NTA-Ni agarose magnetic beads)BeyotimeP2247S
Immun-Blot PVDF Membrane, Roll, 26 cm x 3.3 mBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1620177
Isopropyl alcoholMacklinI811925
M5 Prestained Protein LadderMei5 Biotechnology Co.LtdMF-212-01
MaestroSchrödinger’shttps://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/
Methyl alcoholChina National Medicines Corporation Ltd10014108
MF-MilliporeMilliporeHAWP04700
MyFug mini centrifugeSigmaZ764183
Pierce Dilution-Free Rapid Gold BCA Protein AssayThermo ScientificA55860
PR-619Cell Signaling Technology26065S
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotMacklinP917820
Recombinant Human HA-Ubiquitin Vinyl Sulfone Protein, CFR&D SystemsU-212-025
Recombinant Human Ubiquitin AMC Protein, CFR&D SystemsU-550-050
Skim MilkBecton,Dickinson and Company232100
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Ameresco, Inc.205-788-1
TEMEDAmeresco, Inc.2545C134
Tween 20Beijing Lablead Biotech Co., Ltd0777-1
UCHL3 (D25E6) Rabbit mAbCell Signaling Technology8141T

参考文献

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