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요약

여기에 사용된 실험은 중국 전통 의학의 소분자와 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하기 위해 프로브 기술과 결합된 분자 도킹 방법을 보여줍니다.

초록

탈유비퀴틴 효소(DUB)는 유비퀴틴화 항상성을 조절하는 데 중추적인 역할을 하며, UCHL3는 무수한 생리학적 및 병리학적 과정에 복잡하게 관여하는 전형적인 시스테인 DUB입니다. 따라서 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 L3(UCHL3)를 표적으로 하는 저분자 억제제를 개발하는 것은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 UCHL3로 대표되는 시스테인 DUB의 소분자 억제제에 대한 가상 스크리닝 및 체외 검증을 위한 프로세스를 확립하는 것을 목표로 합니다. 첫째, UCHL3의 잠재적 억제제는 분자 도킹 기술을 사용하여 가상으로 스크리닝되고 약물과 단백질 표적 간의 상호 작용이 시각화됩니다. 그 후, 스크리닝 약물인 Danshensu의 효과는 체외 활성 억제 분석을 통해 검증됩니다. 유비퀴틴-7-아미노-4-메틸쿠마린(Ub-AMC) 및 헤마글루티닌-유비퀴틴-비닐 설폰(HA-Ub-VS)은 UCHL3의 활성을 평가하기 위해 저분자 억제제와 함께 DUB에 경쟁적으로 결합할 수 있기 때문에 체외 활성 테스트용 프로브로 사용됩니다. 결과는 Danshensu가 분자 도킹에서 UCHL3와 우수한 결합 친화도를 가지며 HA-Ub-VS와 UCHL3의 활성을 경쟁적으로 억제할 수 있음을 나타냅니다. 이러한 결과는 UCHL3를 표적으로 하는 치료제의 추가 연구 및 개발에 중요한 참고 자료를 제공합니다.

서문

유비퀴틴화(Ubiquitination)는 단백질의 번역 후 변형(post-translational modification)으로, E1 유비퀴틴 활성화 효소, E2 유비퀴틴 접합 효소 및 E3 유비퀴틴 리가아제가 유비퀴틴을 표적 단백질에 부착하는 과정이며, 유비퀴틴화의 전체 과정은 탈유비퀴틴 효소(DUB)에 의해 역전될 수 있습니다1,2,3,4. DUB는 중요한 생리학적, 병리학적 역할로 인해 신약 개발의 중요한 대상으로 간주됩니다 5,6.

인간에서 100개 이상의 DUB가 확인되었습니다 7,8. 이들은 일반적으로 유비퀴틴의 C-말단과 기질 또는 다른 유비퀴틴 분자의 라이신 잔류 사이의 이소펩타이드 결합을 절단하는 이소펩티다아제로 기능합니다 9,10. 현재 이들은 주로 유비퀴틴 특이적 펩티다아제(USP), 난소 종양 프로테아제(OTU), Jab1/Mov34/Mpr1 Pad 1 N-말단 + 도메인 프로테아제(JAMM), 유비퀴틴 함유 새로운 DUB 패밀리 프로테아제(MINDYs), 유비퀴틴 C-말단 하이드록실라제(UCH), 마차도-조세핀 도메인 프로테아제(MJD) 및 아연 핑거-함유 유비퀴틴 펩티다아제 1(ZUP1)9과 상호 작용합니다. 아연 메탈로프로테아제계열 11에 속하는 JAMM 외에도, 다른 DUB는 촉매 시스테인, 히스티딘 및 세 번째 산성 잔기로 구성된 촉매 삼중체를 특징으로 하는 시스테인 프로테아제입니다12,13. 이러한 특이성은 효소의 활성 부위 또는 인근 알로스테릭 포켓을 표적으로 하는 저분자 억제제를 개발할 수 있는 길을 열어줍니다.

탈유비퀴틴 효소 연구 분야에서는 이들의 활성을 규명하는 데 상당한 어려움이 있습니다14,15. 활성 프로브를 기반으로 한 특성 분석은 DUB 억제제 연구를 위한 중요한 접근 방식으로 작용합니다16. 세포 용해물 또는 재조합 단백질에서 활성 기반 프로브 및 억제제로 경쟁력 있는 분석을 수행함으로써 DUB의 활성을 특성화하여 이러한 효소를 표적으로 하는 저분자 억제제의 개발을 촉진할 수 있습니다. Ub-AMC는 유비퀴틴17,18의 C-말단 말단에 부착된 형광기가 있는 DUB 활성을 감지하는 데 사용되는 초기 프로브입니다. DUB가 촉매 활성을 발휘하면 AMC가 대량으로 방출되고 그에 따라 검출된 빛의 형광 강도가 향상됩니다. 이 프로브는 DUB 억제제19,20의 고처리량 스크리닝에 널리 사용되었습니다. HA-Ub-VS 프로브는 DUB 활성(21)을 측정하기 위해서도 사용된다. 유비퀴틴의 C-terminus에 비닐 설폰기가 있어 DUB의 자살 기질이 됩니다. SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide Gel electrophoresis) 분리 후 웨스턴 블로팅 22,23,24를 사용하여 활성 DUB를 검출할 수 있습니다.

중국 전통 의학(TCM)은 2000년 이상 약용 식물을 사용해 왔습니다. 천연물을 소재로 신약을 개발하는 것은 의학적으로 매우 중요하며, 활성 성분을 규명하고 그 메커니즘을 규명하는 데 중점을 둔다25. 샐비어 miltiorrhiza Bge는 암, 심혈관, 간 및 신경학을 포함한 다양한 질병의 치료에 널리 사용되는 허브입니다26. 현재 tanshinone27, Danshensu28, tanshinic acid29 등과 같은 알려진 소분자를 함유하고 있습니다. 이러한 화합물은 항혈전제, 항산화제, 항종양 효과와 같은 다양한 생물학적 활성을 나타내기 때문에 연구에 매우 가치가 있습니다26. 최근 연구에서는 Danshensu가 SARS-CoV-2의 3-키모트립신 유사 프로테아제(3CLpro)의 공유 억제제로 확인되었습니다30. 3CLpro의 활성 부위 잔류 물 C145와 공유 결합을 형성하는 것으로 나타났으며, 이는 Salvia miltiorrhiza Bge에서 잠재적 인 저분자 단백질 분해 효소 억제제의 존재를 나타냅니다.

유비퀴틴 C-말단 가수분해효소 L3(UCHL3)는 DUB의 UCH 계열에 속하는 시스테인 프로테아제에 속합니다. 그것은 시스테인 95 , 히스티딘 169 및 아스파르트산 184 와 같은 보존 된 잔기에 의존하여 기능을 효과적으로 촉매합니다31 , 32 . 그것은 세포주기, 상동 재조합 및 단백질 결합 DNA 절단의 복구를 포함한 여러 분자 경로에서 중요한 역할을 합니다33. 또한, 난소암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 비소세포폐암과 같은 다양한 암에서 상향 조절된다34. 이러한 연구를 바탕으로 UCHL3는 질병 치료에 대한 유망한 표적으로 보입니다. UCHL3의 여러 소분자 억제제가 확인되었으며 임상 사용을 향해 진행되고 있습니다35,36.

이 연구에서는 Salvia miltiorrhiza Bge와 UCHL3의 소분자 간의 상호 작용을 조사하기 위해 분자 도킹을 수행했습니다. 그 후, DUB 특이적 프로브 Ub-AMC 및 HA-Ub-VS를 사용한 시험관 내 실험에서 Danshensu가 UCHL3의 저분자 억제제로 확인되었습니다. 분자 도킹은 또한 Danshensu의 잠재적 결합 부위를 예측하여 작용 메커니즘을 제안했습니다.

프로토콜

1. Salvia miltiorrhiza Bge와 UCHL3의 소분자 구조 다운로드

  1. small molecule 파일을 다운로드합니다.
    1. TCMSP 데이터베이스(https://old.tcmsp-e.com)를 열고 danshen (허브 이름)을 입력한 다음 검색을 누르고 결과 목록에서 Radix Salviae를 클릭합니다.
    2. 항목 중 하나를 다운로드하고 2D 구조를 .mol2 형식으로 저장 하십시오.
  2. 단백질 파일을 다운로드합니다.
    1. PDB 데이터베이스(https://www.rcsb.org/)를 열고 UCHL3을 입력한 다음 검색을 누릅니다. Homo sapiens를 클릭한 다음 refinements에서 검색을 누릅니다.
    2. small molecule-protein co-crystallization을 사용하여 구조 1XD3 을 선택한 다음 파일 다운로드를 클릭하고 PDB 형식을 선택합니다.

2. 분자 도킹

  1. 파일을 저장합니다.
    1. 바탕 화면에 danshen_UCHL3 docking이라는 새 폴더를 만들고 이 폴더에 Salvia miltiorrhiza Bge 및 UCHL3 구조의 화합물을 저장합니다. 폴더 이름을 영어로 지정하십시오. 그렇지 않으면 파일을 가져올 수 없습니다.
  2. 경로를 설정합니다.
    1. Maestro 소프트웨어를 열고 파일, 작업 디렉토리 변경을 차례로 선택하고 바탕 화면을 클릭한 다음 danshen_CUHL3 도킹 폴더를 두 번 클릭하여 선택하고 옵션 선택을 클릭합니다.
  3. 소분자 가공
    1. 작은 분자 구조를 가져옵니다.
      1. 파일(File) 및 구조 가져오기(Import Structures) 옵션을 클릭합니다. 바탕 화면을 클릭하고 도킹 폴더를 두 번 클릭한 다음 Salvia miltiorrhiza Bge 구조 파일을 클릭합니다. 그런 다음 Open(열기)을 클릭하여 모든 작은 분자를 가져옵니다.
    2. 작은 분자를 준비합니다.
      1. 작업을 클릭하고 LigPrep 옵션을 선택합니다. 표시된 LigPrep 창에서 구조 사용 옵션의 프로젝트 테이블을 클릭하고, 계산에서 3D 구조에서 키랄성 결정 옵션을 선택하고, 다른 모든 소프트웨어 설정은 기본값으로 둡니다.
      2. 작업 이름을 danshen_ligprep1로 변경한 다음 실행을 클릭하여 small molecule 처리를 실행합니다.
  4. 단백질 구조 처리
    1. 단백질 구조를 가져옵니다.
      1. File 및 Import Structures 옵션을 클릭하고 Desktop을 클릭한 다음 danshen_CUHL3 docking 폴더를 두 번 클릭합니다.
      2. UCHL3 단백질 구조 파일을 클릭한 다음 열기를 클릭하여 단백질 구조 파일을 가져옵니다.
    2. 단백질을 준비합니다.
      1. UCHL3와 소분자를 연결하는 두 개의 공유 결합을 선택하고 삭제 버튼을 사용하여 삭제합니다. 그런 다음 삭제 후 불완전한 두 개의 단백질 잔류물을 선택합니다. 빌드 버튼을 클릭하고 기타 편집을 선택한 다음 Gly75의 경우 C 버튼을 클릭하고 Cys95의 경우 Mutate Residue 및 CYS를 선택합니다.
      2. Tasks(작업)를 클릭하고 Protein Preparation Workflow 옵션을 선택합니다. 다른 모든 소프트웨어 설정은 기본값으로 둡니다. 작업 이름을 UCHL3_protein pre로 변경한 다음 Run(실행)을 클릭하여 단백질 처리를 수행합니다.
    3. 도킹 박스를 설정합니다.
      1. Tasks를 클릭하고, Receptor Grid Generation을 선택하고, Pick을 선택하여 리간드 분자를 식별합니다. workspac e에서 작은 분자를 선택하면 작은 분자 좌표를 중심으로 분홍색 도킹 상자가 나타납니다.
      2. 기본 설정을 유지하고 작업 이름을 1XD3_danshen_glide_grid로 지정한 다음 실행을 클릭합니다.
        참고: 1XD3에서 작은 분자는 단백질과 공유 결합을 형성합니다. 단백질에서 소분자를 분리하기 위해 이 공유 결합을 제거해야 합니다. 그렇지 않으면 수용체 그리드 설정 과정에서 작은 분자를 선택할 수 없습니다.
  5. 분자 도킹을 수행합니다.
    1. 작업(Tasks)을 클릭하고 리간드 도킹(Ligand Docking) 옵션을 선택합니다. Receptor Grid를 선택하고 From file(파일에서)을 클릭한 다음 Browse(찾아보기)를 클릭합니다. 1XD3_danshen_glide_grid.zip 파일을 선택하고 열기를 클릭합니다.
    2. Use Ligands from as files(파일로 리간드 사용)를 클릭한 다음 Browse(찾아보기)를 클릭합니다. danshen_ligprep1 파일을 클릭하고 danshen_ligprep1-out. maegz 파일을 선택한 다음 열기를 클릭합니다.
    3. 설정을 클릭하고 정밀도를 SP 옵션으로 선택한 다음 작업 이름을 danshen_UCHL3_ glidedock _SP로 변경하고 실행을 클릭합니다.
  6. 도킹 결과를 봅니다.
    1. 파일(File) 및 구조 가져오기(Import Structures) 옵션을 클릭합니다. 바탕 화면을 클릭하고 danshen_CUHL3 도킹 폴더를 두 번 클릭합니다.
    2. danshen_UCHL3_ glidedock _SP 파일을 두 번 클릭하고 danshen_UCHL3_ glidedock _SP_pv.maegz 파일을 클릭한 다음 열기를 클릭합니다.
    3. 테이블 옵션을 클릭한 다음 도킹 점수에서 점수를 확인합니다.
  7. danshensu 및 UCHL3 상호 작용을 시각화합니다.
    1. danshen_UCHL3_glidedock _SP_pv.maegz 파일을 두 번 클릭하고 Maestro에서 엽니다. 항목 목록에서 Shift 키를 누른 상태에서 danshensu 와 단백질을 동시에 선택합니다.
    2. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Merge 를 선택하여 새 구조를 만듭니다. 새 구조를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 내보내기를 선택하고 구조를 클릭하고 파일 이름을 danshensu_UCHL3 지정한 다음 .pdb 형식으로 내보냅니다.
    3. 패널에서 병합 구조를 선택하고, 작업을 클릭하고, 2D 스케쳐를 선택하고, danshensu와 UCHL3 간의 상호 작용에 대한 2D 구조 그림을 얻습니다.
    4. danshensu_UCHL3.pdb 파일을 pymol 소프트웨어로 가져오고 Maestro에서 얻은 2D 구조를 기반으로 시각화합니다.

3. 단백질 UCHL3의 정제

  1. pHUE-UCHL3 원핵생물 발현 플라스미드의 구축
    1. NCBI(isform2)에서 재조합 단백질 UCHL3 유전자의 암호화 염기서열을 얻습니다. 얻은 유전자 단편을 상동 재조합을 통해 pHUE-10HIS 벡터에 통합하고 DH5α competent cell로 형질전환시킵니다. 플라스미드 DNA를 추출하여 원하는 구조를 얻습니다.
  2. 재조합 단백질의 유도 및 정제
    1. 박테리아 배양:
      1. 재조합 플라스미드를 BL21(DE3) 수용 세포로 형질전환하고 암피실린을 함유한 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에 퍼뜨립니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
      2. 단일 콜로니를 선택하여 50μg/mL 암피실린이 보충된 12mL의 액체 LB 배지에 접종하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    2. 변화와 귀납
      1. 새로운 배지를 사용하여 하룻밤 동안 배양된 박테리아 배양을 2%로 희석합니다. OD600이 0.4-0.6에 도달하면 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 최종 농도 0.4mM에 첨가하여 16°C에서 12시간 동안 저온 유도합니다.
    3. 세균 배양 수집
      1. 박테리아 배양액을 멸균 원심분리기 튜브로 옮기고 2200 x g 에서 10분 동안 원심분리기를 합니다. 상층액을 제거하고 보존을 위해 균주를 -80 °C에서 보관하십시오.
    4. 쥡니다
      1. Buffer 1(50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA)의 25 mL(수집된 박테리아 배양액의 1/20)에 균주를 재현탁합니다. 다음 조건에서 박테리아 초음파 처리를 수행합니다 : 4 초 동안 켜짐, 6 초 동안 꺼짐, 15 분 동안 60 %로 설정된 에너지. 1% 트리톤 X-100을 넣고 4°C에서 30-60분 동안 용해합니다.
    5. 상등액과 펠릿의 분리
      1. 9000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 모아 0.45μm 멤브레인 필터를 통해 여과합니다. 50 μL의 상층액을 입력으로 예약합니다.
      2. 펠릿을 버퍼 1에 재현탁시키고 적당량의 5x 샘플 버퍼(25% 1M Tris-HCl[pH 6.8], 10% 도데실황산나트륨, 0.5% 브로모페놀 블루, 41.67% 글리세롤 및 10% DL-디티오트레이톨)를 추가하고 100°C에서 10분 동안 끓입니다.
  3. 단백질 정제
    1. 컬럼 평형
      1. NiNTA 니켈 수지 1mL를 컬럼에 로드하고 10분 동안 안정화시킨 다음 10mM, 500mM 및 10mM 이미다졸을 포함하는 5 컬럼 부피의 버퍼 2(50mM HEPES pH 7.5, 50mM NaCl)로 컬럼을 순차적으로 평형화합니다.
      2. 피펫을 사용하여 컬럼 벽을 따라 5mL의 10mM 이미다졸 용액을 추가합니다. 유속을 제어하지 않고 이 프로세스를 수행합니다.
      3. 액체가 충전재를 덮고 거의 배수되면 평형을 위해 500mM 이미다졸 용액과 10mM 이미다졸 용액의 5개 컬럼 부피를 순차적으로 추가합니다. 나머지 10mM 이미다졸 용액이 충전재만 덮으면 유량 컨트롤러를 닫아 평형을 중지합니다.
    2. 단백질 정제
      1. 여과된 단백질 상등액을 0.5mL/분(방울당 <15초)의 유속으로 컬럼에 통과시켜 관류 분획을 수집합니다. 0.5M NaCl과 함께 버퍼 2를 사용하여 10mM, 30mM, 50mM 및 100mM 이미다졸의 농도 구배를 준비합니다.
      2. 저농도의 imidazole을 저농도에서 고농도로 순차적으로 용리시키고, 피펫을 사용하여 유속을 제어하지 않고 컬럼 벽을 따라 약 5 컬럼 부피의 용액을 추가합니다. 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 용리액을 수집하고 튜브당 1mL의 플로우 스루를 취합니다.
      3. 5개의 튜브를 수집한 후 각 튜브에서 1μL의 플로우스루를 취하여 1μL의 Bradford 버퍼와 반응합니다. 반응이 파란색으로 유지되면 단계를 계속하십시오. 투명하게 변하면 해당 농도에서 용출을 중지하고 다음 농도로 전환하십시오.
      4. 100mM 이미다졸로 용리한 후 유속을 제어하거나 용리액을 수집하지 않고 0.5M NaCl의 10 컬럼 부피로 세척합니다.
      5. 마지막으로 500mM 이미다졸(방울당 <15초)로 용리합니다. 피펫을 사용하여 용액 1mL를 컬럼에 첨가하여 앞서 언급한 느린 용리 속도를 유지합니다. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 사용하여 용리액 1mL를 수집하고 이 과정을 10회 반복합니다.
    3. Coomassie Brilliant Blue 염색을 사용하여 정제된 단백질을 평가합니다.
      1. 각 그룹에서 10 μL를 채취하고 적절한 5x 샘플 완충액을 추가한 다음 100°C에서 5분 동안 가열하여 이전에 얻은 펠릿, 정제 전 상등액 및 수집된 10개의 단백질 튜브를 정량화합니다.
      2. 소 혈청 알부민(BSA) 표준 용액을 1mg/mL, 500μg/mL 및 100μg/mL로 준비합니다. 그런 다음 적절한 5x 샘플 버퍼를 추가하고 100°C에서 5분 동안 가열합니다.
      3. 샘플에 대해 SDS-PAGE 겔 전기영동을 수행한 다음 겔을 제거하고 저속 셰이커에서 Coomassie Brilliant Blue 용액에 실온(RT)으로 밤새 배양합니다.
      4. 다음날, 탈색을 위해 젤을 탈색 용액(40% 에탄올, 10% 아세트산, 50% H2O)에 옮기고 필요에 따라 부드러운 열을 가합니다. 겔이 투명해지면 현상 기기 아래에서 관찰하여 BSA 수치를 기반으로 정제된 단백질을 정량화하고 단일 밴드를 확인하여 순도를 평가합니다.
    4. 단백질 보관: 단백질을 튜브당 50μL의 마이크로 원심분리 튜브에 분주하고 액체 질소에서 급속 동결한 다음 -80°C에서 보관합니다.

4. UCHL3 활성 분석(Ub-AMC 분석)

  1. 단백질 준비
    1. 단백질을 얼음 위에서 해동하고, 실온에서 1000 x g 에서 3분 동안 샘플을 원심분리한 다음 BCA 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. Buffer 1을 사용하여 단백질을 40nM의 농도로 희석합니다.
  2. 그룹 설정
    1. 버퍼 1을 대조군으로, UCHL3을 실험군으로 지정합니다. 96웰 플레이트에 웰당 각 시료 200μL를 추가하여 그룹당 3회 반복을 설정합니다.
  3. 탐지
    1. 측정 직전에 각 웰에 Ub-AMC를 빠르게 추가하고 2-5초 동안 세게 흔듭니다. 사용된 Ub-AMC의 농도는 250nM입니다. 37°C 조건에서 380nm 여기 파장 및 460nm 방출 파장에서 OD 값을 측정하고 최대 10분 동안 30초마다 판독값을 취합니다.

5. HA-Ub-VS에 의한 UCHL3 활성의 억제 분석 (HA-Ub-VS 분석법)

  1. 단백질 준비
    1. 단백질을 얼음 위에서 해동하고, 실온에서 1000 x g 에서 3분 동안 샘플을 원심분리한 다음 BCA 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 단백질을 10μg/mL의 농도로 희석합니다.
  2. 소분자의 준비
    1. Danshensu의 무게를 측정하고 고순도 물을 사용하여 5mM, 1mM, 100μM, 10μM 및 1μM로 구배로 희석합니다.
  3. 그룹 설정
    1. 순수 단백질 그룹과 저분자 약물이 없는 그룹을 음성 대조군으로 설정합니다. PR619(DUB 억제제)를 양성 대조군으로 사용하고 다른 그룹은 저분자 약물 치료군으로 사용합니다.
  4. 시료 전처리
    1. 그룹에 따라 각 약물 처리 그룹에 해당 농도의 UCHL3 9μL와 단센수 1μL를 순차적으로 추가합니다. 양성 대조군에 1μL의 PR619(사용 시 50μM)를 추가합니다. 고순도 물과 버퍼 1을 사용하여 음성 대조군을 보충합니다.
    2. 볼텍싱으로 완전히 혼합하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 반응 샘플을 얼음 위에 놓고 HA-Ub-VS를 최종 농도 1μM까지 첨가하고 볼텍싱으로 철저히 혼합한 다음 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    3. 적당량의 5x 샘플 버퍼를 추가하고 100°C 금속 수조에서 10분 동안 가열합니다. 샘플을 RT에서 5분 동안 놓고 겔에 로드합니다.

6. 웨스턴 블롯

  1. SDS-PAGE 젤의 준비
    1. 유리 패널 세트를 초순수로 헹굽니다. 플레이트를 clamping 슬롯에 넣은 다음 투명 보드에 놓습니다. 초순수를 넣고 10분 동안 누수 점검을 합니다.
    2. 접착제 분배 테이블에 따라 분리 접착제를 준비합니다.
    3. 젤 카세트에서 고순도 물을 붓고 남은 물을 여과지로 흡수합니다. 준비된 12% 분리 젤을 빠르고 균일하게 첨가합니다. 그런 다음 이소프로판올 1mL를 넣고 겔이 응고될 때까지 약 30분 동안 기다립니다.
    4. 접착제 분배 테이블에 따라 농축 접착제의 최상층을 준비합니다.
    5. 분리 젤 상단의 이소프로판올을 제거하고 고순도 물로 3회 세척한 후 여과지로 두드려 건조시킵니다. 준비한 3% 스태킹 젤을 빠르게 넣고 1.0mm 15홀 빗을 삽입한 후 약 30분 정도 기다립니다.
      알림: 빗을 접착제 표면에 수직으로 유지하고 기포가 나타나지 않도록 합니다.
  2. 전기영동
    1. 빗을 수직으로 제거하고 전기영동 장치의 내부 챔버에 충분한 양의 흐르는 버퍼를 부어 액체가 샘플 웰을 덮도록 합니다.
    2. 단백질 마커와 준비된 실험 샘플을 RT에 놓고 철저히 와류에 넣고 간단히 원심분리합니다. 3 μL의 단백질 마커를 첫 번째 왼쪽 샘플 웰에 추가한 다음 10 μL의 실험 샘플을 각 후속 웰에 추가합니다.
    3. 전기영동 탱크의 외부 챔버에 적당량의 러닝 버퍼를 추가하고 탱크를 뚜껑으로 덮고 전원 공급 장치를 연결합니다. 전원 공급 장치가 올바르게 연결되어 있는지 확인하십시오.
    4. 전원 공급 장치를 켜고 샘플이 라인에 집중될 때까지 전압을 80V로 설정한 다음 분리 젤에서 분리가 시작되면 전압을 120V로 높입니다.
      알림: 이 과정에서 바닥에 기포가 형성되지 않는지 확인하십시오. 기포가 나타나면 전기영동 장치를 한쪽으로 기울여 기포를 배출하십시오.
  3. 멤브레인으로 이동
    1. 플라스틱 칼을 사용하여 젤 카세트를 들어 올립니다. 방향을 표시하기 위해 샘플 로딩이 시작된 왼쪽 상단의 모서리를 잘라냅니다. 젤과 필요한 여과지를 전사 버퍼에 1-2분 동안 담가둡니다.
    2. 표적 단백질에 필요한 크기에 따라 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인을 측정하고 절단합니다. PVDF 멤브레인을 메탄올에 20초에서 1분 동안 담가두어 활성화한 다음 전사 버퍼에 겔과 함께 담그십시오.
    3. 전사 장치에 소량의 전사 버퍼를 붓고 롤러를 사용하여 반건조 전사 장치를 적십니다. 아래에서 위로 다음 순서로 구성 요소를 정렬합니다: 3개의 여과지, 젤, PVDF 멤브레인 및 3개의 추가 여과지 층.
    4. 각 레이어를 배치한 후 롤러를 사용하여 거품을 제거합니다. 전사 버퍼로 뚜껑을 적신 다음 장치를 덮습니다.
      참고: 적절한 양의 전송 버퍼가 있는지 확인하고 각 계층을 완료한 후 소량을 추가합니다. 샘플이 로드된 겔의 왼쪽과 오른쪽을 구별하고 멤브레인의 앞면과 뒷면을 식별하여 표시를 미리 준비하십시오. 각 층을 놓은 후 부드럽게 굴려 거품을 제거합니다.
    5. 전원 공급 장치를 켜서 극성이 올바른지 확인하십시오. 전류를 190mA로 조정하고 시간을 45분으로 설정합니다.
  4. 블로킹
    1. TBST(1% Tween20)에 5% 무지방 분유 용액을 차단 버퍼로 준비합니다. PVDF 멤브레인을 앞면이 위로 향하게 하여 혼성화 상자에 넣고 10mL의 차단 버퍼를 부은 다음 저속 셰이커에서 RT에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 차단합니다.
  5. 1차 항체의 배양
    1. 1:1000에 항체 용액1로 1차 항체를 준비하고 1차 항체 10mL를 새 배양 상자에 추가합니다. 배양 상자를 4°C의 냉장실에 놓고 셰이커에 밤새 보관합니다.
  6. 2차 항체의 배양
    1. 다음날 인큐베이션 박스에 1차 항체를 모은 다음 적절한 TBST 용액을 넣고 셰이커에 올려 5분 동안 세척하고 3회 반복합니다.
    2. 1:5000에 5% 우유 용액으로 2차 항체를 준비합니다. 2차 항체 1mL를 적신 혼성화 상자 바닥에 떨어뜨립니다. PVDF 멤브레인을 단백질 면이 아래를 향하도록 하여 2차 항체에 올려 놓은 다음 저속 셰이커에서 RT에서 1.5시간 동안 배양합니다.
    3. 적절한 TBST 용액을 넣고 셰이커에 올려 5분 동안 세척합니다. 3회 반복합니다.
  7. 스트립 노출
    1. 화학발광 시약 A와 B를 같은 부피로 취하여 흔들고 잘 섞습니다. 용액을 빛으로부터 보호하십시오.
    2. 현상 용액을 PVDF 멤브레인에 고르게 바르고 부드럽게 흔들어 멤브레인이 용액으로 균일하게 코팅되도록 합니다.
    3. 멤브레인을 겔 이미징 시스템에 배치하고 노출 시간, 노출 횟수 및 기타 관련 매개변수를 설정합니다.
      참고: 개발자는 스트립을 완전히 덮어야 하며 개발은 어두운 환경에서 이루어져야 합니다.

결과

UCHL3를 효과적으로 억제할 수 있는 Salvia miltiorrhiza Bge의 소분자를 선별하기 위해 TCMSP 웹사이트에서 얻은 소분자와 UCHL3 사이의 분자 도킹을 수행했습니다. 도킹 결과의 상위 30개 소분자와 그 점수는 표 1에 나와 있습니다. 모든 소분자에 대한 도킹 결과는 보충 표 1에 제시되어 있습니다. 연구를 위한 대표적인 소분자로 Danshensu를 선택했습니...

토론

DUB는 기질 또는 폴리유비퀴틴 사슬에서 유비퀴틴을 제거함으로써 전체 유비퀴틴 시스템의 항상성을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다37. 최근 몇 년 동안 이러한 효소는 약물 개발의 표적으로도 많은 주목을 받고 있습니다13. 그러나 저분자 약물 개발 과정에는 어려움이 있습니다. 예를 들어, 수만 개의 소분자 라이브러리(small molecule l...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 베이징 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of Beijing)[보조금 번호 7244498]의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
30% AcrylamideBeijing Lablead Biotech Co., LtdA3291
Ammonium persulfateChina National Medicines Corporation Ltd10002616
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074Cell Signaling Technology7074P2
BeyoECL PlusBeyotimeP0018S
Bradford Protein Assay KitBeyotimeP0006
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115-01
DanshensuShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB20254
DMSOAmeresco, Inc.21K2356571
Electrophoresis SystemLiuyi Biotechnology112-0630
HEPESSigmaH3375
His-tagged protein purification kit (NTA-Ni agarose magnetic beads)BeyotimeP2247S
Immun-Blot PVDF Membrane, Roll, 26 cm x 3.3 mBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1620177
Isopropyl alcoholMacklinI811925
M5 Prestained Protein LadderMei5 Biotechnology Co.LtdMF-212-01
MaestroSchrödinger’shttps://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/
Methyl alcoholChina National Medicines Corporation Ltd10014108
MF-MilliporeMilliporeHAWP04700
MyFug mini centrifugeSigmaZ764183
Pierce Dilution-Free Rapid Gold BCA Protein AssayThermo ScientificA55860
PR-619Cell Signaling Technology26065S
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotMacklinP917820
Recombinant Human HA-Ubiquitin Vinyl Sulfone Protein, CFR&D SystemsU-212-025
Recombinant Human Ubiquitin AMC Protein, CFR&D SystemsU-550-050
Skim MilkBecton,Dickinson and Company232100
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Ameresco, Inc.205-788-1
TEMEDAmeresco, Inc.2545C134
Tween 20Beijing Lablead Biotech Co., Ltd0777-1
UCHL3 (D25E6) Rabbit mAbCell Signaling Technology8141T

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