JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הניסוי המשמש כאן מציג שיטה של עגינה מולקולרית בשילוב טכנולוגיות בדיקה כדי לחזות ולאמת את האינטראקציה בין מולקולות קטנות של הרפואה הסינית המסורתית לבין מטרות חלבון.

Abstract

אנזימי דה-ביקוויטינציה (DUBs) ממלאים תפקיד מרכזי בוויסות הומאוסטזיס של ubiquitination, כאשר UCHL3 הוא ציסטאין DUB ארכיטיפי המעורב באופן מורכב במספר עצום של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. לכן, יש חשיבות רבה לפיתוח מעכבי מולקולות קטנות המכוונים ליוביקוויטין C-Terminal Hydrolase L3 (UCHL3). פרוטוקול זה נועד לבסס תהליך לבדיקה וירטואלית ואימות במבחנה של מעכבי מולקולות קטנות של ציסטאין DUB המיוצגים על ידי UCHL3. ראשית, מעכבים פוטנציאליים של UCHL3 נבדקים באופן וירטואלי באמצעות טכנולוגיית עגינה מולקולרית, והאינטראקציה בין תרופות ומטרות חלבון מומחשת. לאחר מכן, יעילותה של התרופה המוקרנת, Danshensu, מאומתת באמצעות מבחני עיכוב פעילות במבחנה . יוביקוויטין-7-אמינו-4-מתילקומרין (Ub-AMC) והמגלוטינין-יוביקוויטין-ויניל סולפון (HA-Ub-VS) משמשים כבדיקות לבדיקת פעילות במבחנה , מכיוון שהם יכולים להיקשר באופן תחרותי ל-DUB עם מעכבי מולקולות קטנות כדי להעריך את הפעילות של UCHL3. התוצאות מצביעות על כך שלדנשנסו יש זיקה טובה ל-UCHL3 בעגינה מולקולרית, והוא יכול לעכב באופן תחרותי את הפעילות של UCHL3 עם HA-Ub-VS. ממצאים אלה מספקים הפניות חשובות להמשך מחקר ופיתוח של תרופות טיפוליות המכוונות ל-UCHL3.

Introduction

Ubiquitination הוא שינוי לאחר תרגום של חלבונים, תהליך שבו אנזימים המפעילים יוביקוויטין E1, אנזימים מצומדים של יוביקוויטין E2 ו-E3 ubiquitin ligases מחברים יוביקוויטין לחלבון המטרה, וניתן להפוך את כל תהליך היוביקוויטינציה על ידי אנזימי דה-ביקוויטינציה (DUBs)1,2,3,4. בשל תפקידם הפיזיולוגי והפתולוגי החשוב, DUBs נחשבים למטרות חשובות לגילוי תרופות 5,6.

למעלה מ-100 DUBs זוהו בבני אדם 7,8. הם מתפקדים בדרך כלל כאיזופפטידאז האחראי על פיצול הקשר האיזופפטידי בין מסוף C של יוביקוויטין לשאריות ליזין במצע או במולקולת יוביקוויטין אחרת 9,10. נכון לעכשיו, הם מסווגים בעיקר לשבע משפחות עיקריות, כלומר: פפטידאזות ספציפיות ליוביקוויטין (USPs), פרוטאזות גידול שחלות (OTUs), Jab1/Mov34/Mpr1 Pad 1 N-terminal + domain (JAMMs), מוטיב המקיים אינטראקציה עם פרוטאזות חדשות ממשפחת DUB המכילות יוביקוויטין (MINDYs), הידרוקסילאזות יוביקוויטין C-terminal (UCHs), פרוטאזות תחום מצ'אדו-ג'וזפין (MJDs) ופפטידאז יוביקוויטין 1 המכיל אצבע אבץ (ZUP1)9. בנוסף ל-JAMMs, השייכים למשפחת האבץ מטאלופרוטיאז11, ה-DUBs האחרים הם פרוטאזות ציסטאין המאופיינות בשלישייה קטליטית המורכבת מציסטאין קטליטי, היסטידין, ושאריות חומציות שלישיות 12,13. ספציפיות זו פותחת דרכים לפיתוח מעכבי מולקולות קטנות המכוונים לאתר הפעיל של האנזים או לכיסים אלוסטריים סמוכים.

בתחום חקר אנזימי הדוביקוויטינציה קיים אתגר משמעותי באפיון פעילותם14,15. האפיון המבוסס על בדיקות אקטיביות משמש כגישה מכרעת לחקר מעכבי DUB16. על ידי ביצוע בדיקות תחרותיות עם בדיקות ומעכבים מבוססי פעילות בליזאטים של תאים או חלבונים רקומביננטיים, ניתן לאפיין את פעילותם של DUBs, מה שמקל על פיתוח מעכבי מולקולות קטנות המכוונים לאנזימים אלה. Ub-AMC היא בדיקה מוקדמת המשמשת לאיתור פעילות DUB, שיש לה קבוצה פלואורסצנטית המחוברת לקצה מסוף C של היוביקוויטין 17,18. כאשר DUBs מפעילים את פעילותם הקטליטית, AMC משתחרר בכמויות גדולות, ועוצמת הפלואורסצנט של האור המזוהה שלו מוגברת בהתאם. בדיקה זו הייתה בשימוש נרחב בהקרנה בתפוקה גבוהה של מעכבי DUB19,20. הגשושית HA-Ub-VS משמשת גם למדידת פעילות DUB21. יש לו קבוצת ויניל סולפון בקצה C של יוביקוויטין, מה שהופך אותו למצע התאבדות ל-DUBs. לאחר הפרדת אלקטרופורזה של נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE), ניתן לזהות DUBs פעילים באמצעות כתמים מערביים 22,23,24.

הרפואה הסינית המסורתית משתמשת בצמחי מרפא כבר יותר מ-2000 שנה. לפיתוח תרופות חדשות ממוצרים טבעיים יש חשיבות רפואית רבה, עם דגש מרכזי על זיהוי החומרים הפעילים והבהרת המנגנונים שלהם25. Salvia miltiorrhiza Bge הוא צמח מרפא בשימוש נרחב לטיפול במגוון מחלות, כולל סרטן, לב וכלי דם, כבד ונוירולוגי26. נכון לעכשיו, הוא מכיל מולקולות קטנות ידועות כמו טנשינון27, דנשנסו28, חומצה טנשינית29 וכו '. תרכובות אלו מציגות פעילויות ביולוגיות מגוונות כגון השפעות אנטי-טרומבוטיות, נוגדות חמצון ואנטי-גידולים, מה שהופך אותן לעלות ערך רב למחקר26. מחקרים אחרונים זיהו את Danshensu כמעכב קוולנטי של פרוטאז דמוי 3-כימוטריפסין (3CLpro) של SARS-CoV-230. הוכח כי הוא יוצר קשר קוולנטי עם שאריות האתר הפעיל C145 של 3CLpro, מה שמעיד על נוכחותם של מעכבי פרוטאז פוטנציאליים של מולקולות קטנות ב-Salvia miltiorrhiza Bge.

יוביקוויטין C-Terminal Hydrolase L3 (UCHL3) שייך לפרוטאזות ציסטאין במשפחת UCH של DUBs. הוא מסתמך על שאריות שמורות כמו ציסטאין95, היסטידין169 וחומצה אספרטית184 כדי לזרז את תפקודיו ביעילות31,32. הוא ממלא תפקידים מכריעים במסלולים מולקולריים מרובים, כולל מחזור התא, רקומבינציה הומולוגית ותיקון שבירות DNA המקושרות לחלבון33. בנוסף, הוא מווסת בסוגי סרטן שונים כגון סרטן השחלות, הערמונית, הלבלב, המעי הגס וסרטן ריאות של תאים לא קטנים34. בהתבסס על מחקרים אלה, נראה כי UCHL3 הוא יעד מבטיח לטיפול במחלות. מספר מעכבי מולקולות קטנות של UCHL3 זוהו ומתקדמים לקראת שימוש קליני 35,36.

במחקר זה, בוצעה עגינה מולקולרית כדי לחקור אינטראקציות בין מולקולות קטנות מ-Salvia miltiorrhiza Bge ו-UCHL3. לאחר מכן, ניסוי חוץ גופי באמצעות בדיקות ספציפיות ל-DUB UB-AMC ו-HA-Ub-VS זיהה את Danshensu כמעכב מולקולות קטנות של UCHL3. עגינה מולקולרית גם חזה אתרי קישור פוטנציאליים לדאנסו, מה שמרמז על מנגנון הפעולה שלו.

Protocol

1. הורדת המבנים של מולקולות קטנות של Salvia miltiorrhiza Bge ו- UCHL3

  1. הורד את קובץ המולקולה הקטנה.
    1. פתח את מסד הנתונים של TCMSP (https://old.tcmsp-e.com), הזן danshen (שם עשב), ולאחר מכן לחץ על חיפוש ולחץ על Radix Salviae ברשימת התוצאות.
    2. לחץ על הורד אחד אחד מהפריטים ושמור את המבנה הדו-ממדי בפורמט .mol2.
  2. הורד את קובץ החלבון.
    1. פתח את מסד הנתונים של PDB (https://www.rcsb.org/), הזן UCHL3 ולאחר מכן לחץ על חיפוש. לחץ על הומו ספיינס ולאחר מכן לחץ על חיפוש בשכלולים.
    2. בחר מבנה 1XD3 עם התגבשות משותפת של מולקולה וחלבון קטן, ולאחר מכן לחץ על הורד קבצים ובחר בפורמט PDB .

2. עגינה מולקולרית

  1. שמור את הקובץ.
    1. צור תיקיה חדשה בשם danshen_UCHL3 עגינה על שולחן העבודה ושמור את התרכובות של מבני Salvia miltiorrhiza Bge ו- UCHL3 בתיקיה זו. תן שם לתיקיה באנגלית; אחרת, ייבוא הקובץ ייכשל.
  2. קבעו את הנתיב.
    1. פתחו את תוכנת Maestro, לחצו על 'קובץ', בחרו 'שינוי ספריית עבודה', לחצו על 'שולחן עבודה', לחצו פעמיים לבחירת תיקיית העגינה danshen_CUHL3 ולחצו על 'בחר אפשרויות'.
  3. עיבוד מולקולות קטנות
    1. ייבא מבנים של מולקולות קטנות.
      1. לחץ על אפשרויות File ו-Import Structures. נקישה שולחן עבודה, לחץ פעמיים על תיקיית העגינה ולחץ על קובץ מבנה Salvia miltiorrhiza Bge. לאחר מכן, לחץ על פתח כדי לייבא את כל המולקולות הקטנות.
    2. הכן את המולקולה הקטנה.
      1. לחץ על משימות ובחר באפשרות LigPrep . בחלון LigPrep המוצג, לחץ על טבלת הפרוייקט באפשרות השתמש במבנה מתוך , סמן את האפשרות קבע כיראליות ממבנה תלת-ממדי תחת חישוב והשאר את כל הגדרות התוכנה האחרות כברירת מחדל.
      2. שנה את שם המשימה ל- danshen_ligprep1 ולאחר מכן לחץ על הפעל כדי לבצע עיבוד של מולקולות קטנות.
  4. עיבוד מבנה חלבון
    1. ייבא את מבנה החלבון.
      1. לחץ על האפשרויות File and Import Structures , לחץ על Desktop ולחץ פעמיים על תיקיית העגינה danshen_CUHL3.
      2. לחץ על קובץ מבנה החלבון UCHL3 ולאחר מכן לחץ על פתח כדי לייבא את קובץ מבנה החלבון.
    2. מכינים את החלבון.
      1. בחר את שני הקשרים הקוולנטיים המחברים בין UCHL3 למולקולה הקטנה, ומחק אותם באמצעות כפתור המחיקה . לאחר מכן, בחר את שתי שאריות החלבון שלא הושלמו לאחר המחיקה. לחץ על כפתור הבנייה , בחר עריכות אחרות ולאחר מכן עבור Gly75 לחץ על כפתור C , עבור Cys95 בחר Mutate Residue ו-CYS.
      2. לחץ על משימות ובחר באפשרות זרימת עבודה להכנת חלבון . השאר את כל הגדרות התוכנה האחרות כברירת מחדל. שנה/י את שם המשימה ל ״UCHL3_protein מראש״ ולאחר מכן לחץ/י על ״הפעל״ כדי לבצע עיבוד חלבון.
    3. הגדר את תיבת העגינה.
      1. לחץ על משימות, בחר Receptor Grid Generation ובחר Pick כדי לזהות את מולקולת הליגנד . בחר את המולקולה הקטנה ב-workspac e, ותופיע תיבת עגינה ורודה שבמרכזה קואורדינטות המולקולות הקטנות.
      2. שמור את הגדרות ברירת המחדל, תן למשימה את השם 1XD3_danshen_glide_grid ולאחר מכן לחץ על הפעל.
        הערה: ב-1XD3, המולקולה הקטנה יוצרת קשר קוולנטי עם החלבון. יש צורך להסיר את הקשר הקוולנטי הזה כדי להפריד את המולקולה הקטנה מהחלבון. אחרת, במהלך תהליך הגדרת רשת הקולטנים, לא ניתן לבחור את המולקולה הקטנה.
  5. בצע עגינה מולקולרית.
    1. לחץ על משימות ובחר באפשרות עגינה של ליגנד . בחר את רשת הקולטן, לחץ על מקובץ ולאחר מכן לחץ על עיון. בחר קובץ 1XD3_danshen_glide_grid.zip ולאחר מכן לחץ על פתח.
    2. לחץ על השתמש בליגנדים מתוך כקבצים ולאחר מכן לחץ על עיון. לחץ על קובץ danshen_ligprep1, בחר danshen_ligprep1-out. קובץ maegz ולאחר מכן לחץ על פתח.
    3. לחץ על Settings ובחר באפשרות Precision as SP , שנה את שם המשימה ל- danshen_UCHL3_ glidedock _SP ולחץ על Run.
  6. הצג את תוצאות העגינה.
    1. לחץ על אפשרויות File ו-Import Structures . לחץ על שולחן העבודה ולחץ פעמיים על תיקיית העגינה של danshen_CUHL3.
    2. לחץ פעמיים על קובץ _SP glidedock danshen_UCHL3_, לחץ על הקובץ danshen_UCHL3_ glidedock _SP_pv.maegz ולאחר מכן לחץ על פתח.
    3. לחץ על האפשרות טבלה ולאחר מכן הצג את הניקוד תחת ניקוד עגינה.
  7. דמיין אינטראקציות danshensu ו-UCHL3.
    1. לחץ פעמיים על הקובץ danshen_UCHL3_glidedock _SP_pv.maegz ופתח אותו ב-Maestro. ברשימת הכניסה, החזק את Shift ובו זמנית בחר danshensu ואת החלבון.
    2. לחצו לחיצה ימנית ובחרו Merge ליצירת מבנה חדש. בחר/י את המבנה החדש, לחץ/י לחיצה ימנית, בחר/י ״ייצא״ ולאחר מכן לחץ/י על ״מבנים״, תן לקובץ את danshensu_UCHL3 השם וייצא/י אותו במבנה .pdb.
    3. בחרו במבנה המיזוג בחלונית, לחצו על 'משימות', בחרו 'שרטט דו-ממדי' וקבלו תמונת מבנה דו-ממדית של האינטראקציה בין danshensu ל-UCHL3.
    4. ייבא את הקובץ danshensu_UCHL3.pdb לתוכנת pymol והדמיה על סמך המבנה הדו-ממדי שהתקבל ממאסטרו.

3. טיהור חלבון UCHL3

  1. בניית פלסמיד הביטוי הפרוקריוטי pHUE-UCHL3
    1. השג את רצף הקידוד של גן החלבון הרקומביננטי UCHL3 מ-NCBI (isform2). לשלב את מקטע הגן המתקבל בווקטור pHUE-10HIS באמצעות רקומבינציה הומולוגית ולהפוך אותו לתאים בעלי יכולת DH5α. חלץ את ה-DNA של הפלסמיד כדי להשיג את המבנה הרצוי.
  2. אינדוקציה וטיהור של חלבונים רקומביננטיים
    1. תרבית חיידקים:
      1. הפוך את הפלסמידים הרקומביננטיים לתאים מוכשרים BL21 (DE3) ופזר אותם על לוחות אגר לוריא-ברטאני (LB) המכילים אמפיצילין. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      2. בחרו מושבות בודדות, חסנו אותן ל-12 מ"ל של מדיום LB נוזלי בתוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין, ותרבבו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. טרנספורמציה ואינדוקציה
      1. מדללים את תרבית החיידקים למשך הלילה ל-2% באמצעות מדיום טרי. כאשר OD600 הגיע ל-0.4-0.6, הוסף איזופרופיל-בטא-D-תיוגלקטופיראנוזיד (IPTG) לריכוז סופי של 0.4 מ"מ לאינדוקציה בטמפרטורה נמוכה ב-16 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
    3. אוסף תרבית חיידקים
      1. העבירו את תרבית החיידקים לצינורות צנטריפוגה סטריליים וצנטריפוגה בטמפרטורה של 2200 x גרם למשך 10 דקות. הסר את הסופרנטנט ואחסן את הזנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימור.
    4. סוניקציה
      1. השעו מחדש את הזן ב-25 מ"ל (1/20 מתרבית החיידקים שנאספה) של מאגר 1 (50 מ"מ HEPES pH 7.5, 200 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA). בצע סוניקציה חיידקית בתנאים הבאים: מופעל למשך 4 שניות, כבוי למשך 6 שניות, אנרגיה מוגדרת על 60%, למשך 15 דקות. יש להוסיף 1% טריטון X-100 וליז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
    5. הפרדת סופרנטנט וגלולה
      1. צנטריפוגה את הדגימה ב-9000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אוספים את הסופרנטנט ומסננים אותו דרך מסנן ממברנה של 0.45 מיקרומטר. שמור 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט כקלט.
      2. יש להשהות מחדש את הגלולה במאגר 1, להוסיף כמות מתאימה של מאגר דגימה פי 5 (25% 1M Tris-HCl [pH 6.8], 10% נתרן דודציל סולפט, 0.5% ברומופנול כחול, 41.67% גליצרול ו-10% DL-דיתיותרייטול), ולהרתיח ב-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. טיהור חלבונים
    1. שיווי משקל עמודות
      1. טען 1 מ"ל של שרף ניקל NiNTA לתוך העמודה, אפשר לו להתיישב במשך 10 דקות, ולאחר מכן אזן את העמודה ברצף עם 5 נפחי עמודה של מאגר 2 (50 מ"מ HEPES pH 7.5, 50 מ"מ NaCl) המכיל 10 מ"מ, 500 מ"מ ו-10 מ"מ אימידזול.
      2. השתמש בפיפטה כדי להוסיף 5 מ"ל (כ-5 נפחי עמודים) מתמיסת האימידזול של 10 מ"מ לאורך דופן העמוד. בצע תהליך זה מבלי לשלוט בקצב הזרימה.
      3. ברגע שהנוזל מכסה רק את חומר האריזה וכמעט מתנקז, הוסף ברצף 5 נפחי עמודות של תמיסת אימידזול של 500 מ"מ ותמיסת אימידזול של 10 מ"מ לשיווי משקל. כאשר תמיסת האימידזול הנותרת של 10 מ"מ מכסה רק את חומר האריזה, סגור את בקר הזרימה כדי לעצור את שיווי המשקל.
    2. טיהור חלבונים
      1. העבירו את החלבון המסונן דרך העמודה בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה (<15 שניות לטיפה), ואספו את חלק הזרימה. הכן שיפוע ריכוז של 10 מ"מ, 30 מ"מ, 50 מ"מ ו-100 מ"מ אימידזול באמצעות מאגר 2, יחד עם 0.5 מ' NaCl.
      2. יש להוציא ברצף מריכוזים נמוכים לגבוהים של אימידזול, באמצעות פיפטה כדי להוסיף כ-5 נפחי עמודה של תמיסה לאורך דופן העמוד מבלי לשלוט בקצב הזרימה. אסוף את ה-eluate בצינורות מיקרו-צנטריפוגה נקיים של 1.5 מ"ל, תוך זרימה של 1 מ"ל לכל צינור.
      3. לאחר איסוף חמישה צינורות, קח 1 מיקרוליטר של זרימה מכל צינור כדי להגיב עם 1 מיקרוליטר של מאגר ברדפורד. אם התגובה נשארת כחולה, המשך בשלבים; אם הוא הופך לשקוף, הפסק את הפליטה בריכוז זה ועבור לריכוז הבא.
      4. לאחר הוצאה עם 100 מ"מ אימידזול, יש לשטוף עם 10 נפחי עמודות של 0.5 M NaCl מבלי לשלוט בקצב הזרימה או לאסוף את הפליטה.
      5. לבסוף, עם 500 מ"מ אימידזול (<15 שניות לטיפה). בעזרת פיפטה, הוסף 1 מ"ל מהתמיסה לעמודה, תוך שמירה על קצב הפליטה האיטי הנ"ל. אסוף 1 מ"ל מהפליטה באמצעות צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, וחזור על תהליך זה 10 פעמים.
    3. העריכו את החלבון המטוהר באמצעות צביעה כחולה מבריקה של Coomassie.
      1. כמת את הגלולה שהושגה בעבר, סופרנטנט טרום טיהור ו-10 צינורות החלבון שנאספו על ידי לקיחת 10 מיקרוליטר מכל קבוצה והוספת מאגר הדגימה המתאים פי 5, ולאחר מכן חימום ב-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      2. הכן את התמיסה הסטנדרטית של אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-1 מ"ג/מ"ל, 500 מיקרוגרם/מ"ל ו-100 מיקרוגרם/מ"ל. לאחר מכן הוסף את מאגר הדגימה המתאים פי 5 וחמם ב-100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      3. בצע אלקטרופורזה של ג'ל SDS-PAGE על הדגימות, ולאחר מכן הסר את הג'ל ודגר אותו בטמפרטורת החדר (RT) בתמיסת Coomassie Brilliant Blue על שייקר במהירות נמוכה למשך הלילה.
      4. למחרת, העבירו את הג'ל לתמיסה להסרת צבע (40% אתנול, 10% חומצה אצטית, 50% H2O) להסרת צבע, תוך הפעלת חום עדין לפי הצורך. לאחר שהג'ל שקוף, התבונן תחת מכשיר פיתוח כדי לכמת את החלבון המטוהר על סמך רמות BSA ולהעריך את הטוהר על ידי בדיקת רצועה בודדת.
    4. אחסון חלבון: יש להוציא את החלבון לצינורות מיקרו-צנטריפוגה ב-50 מיקרוליטר לשפופרת, להקפיא בזק בחנקן נוזלי ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.

4. בדיקת פעילות UCHL3 (בדיקת Ub-AMC)

  1. הכנת חלבון
    1. להפשיר את החלבון על קרח, לצנטריפוגה את הדגימה ב-1000 x גרם ב-RT למשך 3 דקות, ולקבוע את ריכוז החלבון בשיטת BCA. יש לדלל את החלבון לריכוז של 40 ננומטר באמצעות Buffer 1.
  2. הגדרת קבוצות
    1. ייעד את Buffer 1 כקבוצת הביקורת ואת UCHL3 כקבוצת הניסוי. הוסף 200 מיקרוליטר מכל דגימה לבאר בצלחת של 96 בארות, והגדר 3 שכפולים לכל קבוצה.
  3. זיהוי
    1. רגע לפני המדידה, הוסף במהירות את Ub-AMC לכל באר ונער במרץ במשך 2-5 שניות. ריכוז ה- Ub-AMC בשימוש הוא 250 ננומטר. מדוד ערכי OD באורך גל עירור של 380 ננומטר ואורך גל פליטה של 460 ננומטר בתנאי 37 מעלות צלזיוס, תוך ביצוע קריאות כל 30 שניות למשך עד 10 דקות.

5. בדיקת עיכוב של פעילות UCHL3 על ידי HA-Ub-VS (בדיקת HA-Ub-VS)

  1. הכנת חלבון
    1. להפשיר את החלבון על קרח, לצנטריפוגה את הדגימה ב-1000 x גרם ב-RT למשך 3 דקות, ולקבוע את ריכוז החלבון בשיטת BCA. לדלל את החלבון לריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל.
  2. הכנת מולקולות קטנות
    1. שקלו Danshensu ודללו אותו בשיפוע באמצעות מים בטוהר גבוה ל-5 מ"מ, 1 מ"מ, 100 מיקרומטר, 10 מיקרומטר ו-1 מיקרומטר.
  3. הגדרת קבוצות
    1. הגדר את קבוצת החלבון הטהור ואת הקבוצה ללא תרופות מולקולות קטנות כקבוצות ביקורת שליליות. השתמש ב-PR619 (מעכב DUB) כקבוצת הביקורת החיובית, ובקבוצות האחרות כקבוצות הטיפול בתרופות במולקולות קטנות.
  4. הכנת מדגם
    1. על פי הקבוצה, הוסף ברצף 9 מיקרוליטר של UCHL3 ו-1 מיקרוליטר של Dansensu בריכוזים המתאימים לכל קבוצה שטופלה בתרופה. הוסף 1 μL של PR619 (50 μM בשימוש) לקבוצת הבקרה החיובית. השתמש במים בעלי טוהר גבוה ובמאגר 1 כדי לפצות על קבוצת הביקורת השלילית.
    2. מערבבים היטב על ידי מערבולת, ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מניחים את דגימות התגובה על קרח, מוסיפים HA-Ub-VS לריכוז סופי של 1 מיקרומטר, מערבבים היטב על ידי מערבולת ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. הוסף כמות מתאימה של מאגר דגימה פי 5 וחמם באמבט מתכת של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שים את הדגימות ב-RT למשך 5 דקות והעמיס על הג'ל.

6. כתם מערבי

  1. הכנת ג'ל SDS-PAGE
    1. שוטפים סט לוחות זכוכית במים טהורים במיוחד. הניחו את הצלחות לתוך חריץ ההידוק, ואז על לוח שקוף. הוסף מים טהורים במיוחד ובדיקת נזילות למשך 10 דקות.
    2. הכן את דבק ההפרדה על פי שולחן חלוקת הדבק.
    3. יוצקים את המים בטוהר גבוה מקלטת הג'ל וסופגים את כל המים שנותרו בנייר פילטר. מוסיפים במהירות ובאופן שווה את ג'ל ההפרדה המוכן של 12%. לאחר מכן הוסיפו 1 מ"ל איזופרופנול והמתינו כ-30 דקות עד שהג'ל מתמצק.
    4. הכן את השכבה העליונה של הדבק המרוכז על פי טבלת חלוקת הדבק.
    5. הסר את האיזופרופנול מהחלק העליון של הג'ל המפריד, שטוף אותו 3 פעמים במים בטוהר גבוה וייבש בנייר פילטר. הוסיפו במהירות את ג'ל הערימה המוכן של 3%, הכניסו מסרק 1.0 מ"מ עם 15 חורים והמתינו כ-30 דקות.
      הערה: שמור את המסרק בניצב למשטח הדבק, וודא שלא מופיעות בועות אוויר.
  2. אלקטרופורזה
    1. הסר אנכית את המסרק ושפך כמות מספקת של מאגר רץ לתוך החדר הפנימי של מנגנון האלקטרופורזה, וודא שהנוזל מכסה את בארות הדגימה.
    2. הנח את סמן החלבון ואת דגימות הניסוי המוכנות ב-RT, מערבולת ביסודיות וקצר צנטריפוגה. הוסף 3 מיקרוליטר של סמן חלבון לבאר הדגימה השמאלית הראשונה, ואחריה 10 מיקרוליטר של דגימת ניסוי לכל באר שלאחר מכן.
    3. הוסף כמות מתאימה של מאגר רץ לתא החיצוני של מיכל האלקטרופורזה, כסה את המיכל במכסה שלו וחבר את ספק הכוח. ודא שספק הכוח מחובר כהלכה.
    4. הפעל את ספק הכוח והגדר את המתח ל-80 וולט עד שהדגימות מתרכזות לקווים, ולאחר מכן הגדל את המתח ל-120 וולט ברגע שמתחילה ההפרדה בג'ל ההפרדה.
      הערה: במהלך התהליך, ודא שלא נוצרות בועות בתחתית. אם מופיעות בועות, הטה את מנגנון האלקטרופורזה לצד אחד כדי להוציא אותן.
  3. מעבירים לממברנה
    1. השתמש בסכין פלסטיק כדי לפתוח את קלטת הג'ל. חותכים פינה בפינה השמאלית העליונה שבה החלה טעינת הדגימה כדי לסמן את הכיוון. משרים את הג'ל ונייר הסינון הנדרש במאגר ההעברה למשך 1-2 דקות.
    2. מדוד וחתוך את קרום הפוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) בהתאם לגודל הדרוש לחלבון המטרה. הפעל את קרום ה-PVDF על ידי השרייתו במתנול למשך 20 שניות עד דקה אחת, ולאחר מכן טבל אותו עם הג'ל במאגר ההעברה.
    3. יוצקים כמות קטנה של מאגר העברה לתוך מנגנון ההעברה, והשתמשו ברולר כדי להרטיב את יחידת ההעברה היבשה למחצה. מסדרים את הרכיבים בסדר הבא מלמטה למעלה: שלוש שכבות של נייר פילטר, ג'ל, קרום PVDF ושלוש שכבות נוספות של נייר פילטר.
    4. לאחר הנחת כל שכבה, השתמש ברולר כדי להסיר בועות. הרטיבו את המכסה עם מאגר העברה ולאחר מכן כסו את המכשיר.
      הערה: ודא שיש כמות מספקת של מאגר העברה, והוסף כמות קטנה לאחר השלמת כל שכבה. הכן סימונים מראש, הבחנה בין הצד השמאלי והימני של הג'ל בו נטענו דגימות, כמו גם זיהוי החלק הקדמי והאחורי של הממברנה. לאחר הנחת כל שכבה, מגלגלים בעדינות כדי להסיר בועות.
    5. הפעל את ספק הכוח, והבטיח קוטביות נכונה. כוונן את הזרם ל-190 mA והגדר את הזמן ל-45 דקות.
  4. חסימת
    1. הכינו תמיסת חלב יבש ללא שומן של 5% ב-TBST (1% Tween20) כמאגר החוסם. הנח את קרום ה-PVDF כשהצד הקדמי כלפי מעלה לתוך קופסת הכלאה, שפך פנימה 10 מ"ל של מאגר חוסם, ונער בעדינות על שייקר במהירות נמוכה ב-RT למשך שעה אחת כדי לחסום.
  5. דגירה של נוגדן ראשוני
    1. הכן את הנוגדן הראשוני עם תמיסת נוגדנים 1 בשעה 1:1000 והוסף 10 מ"ל של נוגדן ראשוני לקופסת הדגירה החדשה. מניחים את קופסת הדגירה בחדר קר של 4 מעלות צלזיוס ושומרים אותה על שייקר למשך הלילה.
  6. דגירה של נוגדנים משניים
    1. אספו את הנוגדן העיקרי בקופסת הדגירה למחרת, ואז הוסיפו תמיסת TBST מתאימה והניחו אותה על שייקר לשטיפה למשך 5 דקות, חזרו על הפעולה 3 פעמים.
    2. הכן את הנוגדן המשני עם תמיסת חלב 5% ב -1:5000. זרוק 1 מ"ל של נוגדן משני על תחתית קופסת הכלאה לחה. הנח את קרום ה-PVDF כשצד החלבון פונה כלפי מטה על הנוגדן המשני, ולאחר מכן דגירה ב-RT על שייקר במהירות נמוכה למשך 1.5 שעות.
    3. הוסף תמיסת TBST מתאימה והניח אותה על שייקר לשטיפה למשך 5 דקות; חזור על הפעולה 3 פעמים.
  7. חשיפת הרצועות
    1. קח כמויות שוות של ריאגנטים כימילומינסצנטיים A ו-B, נער וערבב היטב. הגן על התמיסה מפני אור.
    2. מרחו את התמיסה המתפתחת באופן שווה על קרום ה-PVDF, נערו אותה בעדינות כדי להבטיח שהממברנה מצופה באופן אחיד בתמיסה.
    3. הנח את הממברנה במערכת הדמיית הג'ל והגדר את זמן החשיפה, מספר החשיפות ופרמטרים רלוונטיים אחרים.
      הערה: על המפתח לכסות לחלוטין את הרצועה, והפיתוח צריך להיות בסביבה חשוכה.

תוצאות

כדי לסנן את המולקולות הקטנות ב-Salvia miltiorrhiza Bge שיכולות לעכב ביעילות את UCHL3, ביצענו עגינה מולקולרית בין המולקולות הקטנות שהתקבלו מאתר TCMSP עם UCHL3. 30 המולקולות הקטנות המובילות בתוצאות העגינה והציונים שלהן מוצגים בטבלה 1. תוצאות העגינה עבור כל המולקולות הקטנות מוצ...

Discussion

DUBs ממלאים תפקיד מכריע בוויסות ההומאוסטזיס של כל מערכת היוביקוויטין על ידי הסרת יוביקוויטין ממצעים או שרשראות פוליוביקוויטין37. בשנים האחרונות, אנזימים אלה משכו תשומת לב רבה גם כמטרות לפיתוח תרופות13. עם זאת, ישנם אתגרים בתהליך פיתוח תרופות במול?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

העבודה הזו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של בייג'ינג [מענק מספר 7244498].

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
30% AcrylamideBeijing Lablead Biotech Co., LtdA3291
Ammonium persulfateChina National Medicines Corporation Ltd10002616
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074Cell Signaling Technology7074P2
BeyoECL PlusBeyotimeP0018S
Bradford Protein Assay KitBeyotimeP0006
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115-01
DanshensuShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB20254
DMSOAmeresco, Inc.21K2356571
Electrophoresis SystemLiuyi Biotechnology112-0630
HEPESSigmaH3375
His-tagged protein purification kit (NTA-Ni agarose magnetic beads)BeyotimeP2247S
Immun-Blot PVDF Membrane, Roll, 26 cm x 3.3 mBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1620177
Isopropyl alcoholMacklinI811925
M5 Prestained Protein LadderMei5 Biotechnology Co.LtdMF-212-01
MaestroSchrödinger’shttps://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/
Methyl alcoholChina National Medicines Corporation Ltd10014108
MF-MilliporeMilliporeHAWP04700
MyFug mini centrifugeSigmaZ764183
Pierce Dilution-Free Rapid Gold BCA Protein AssayThermo ScientificA55860
PR-619Cell Signaling Technology26065S
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotMacklinP917820
Recombinant Human HA-Ubiquitin Vinyl Sulfone Protein, CFR&D SystemsU-212-025
Recombinant Human Ubiquitin AMC Protein, CFR&D SystemsU-550-050
Skim MilkBecton,Dickinson and Company232100
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Ameresco, Inc.205-788-1
TEMEDAmeresco, Inc.2545C134
Tween 20Beijing Lablead Biotech Co., Ltd0777-1
UCHL3 (D25E6) Rabbit mAbCell Signaling Technology8141T

References

  1. Ciechanover, A. The ubiquitin proteolytic system and pathogenesis of human diseases: A novel platform for mechanism-based drug targeting. Biochem Soc Trans. 31 (2), 474-481 (2003).
  2. Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by e1 enzymes: The apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 319-331 (2009).
  3. Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (11), 755-764 (2009).
  4. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (10), 626-642 (2016).
  5. Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. Breaking the chains: Structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).
  6. Clague, M. J., et al. Deubiquitylases from genes to organism. Physiol Rev. 93 (3), 1289-1315 (2013).
  7. Clague, M. J., Urbé, S., Komander, D. Breaking the chains: Deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (6), 338-352 (2019).
  8. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: Emerging opportunities. Nat Rev Drug Discov. 17 (1), 57-78 (2018).
  9. Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of deubiquitinase specificity and regulation. Annu Rev Biochem. 86, 159-192 (2017).
  10. Hershko, A., Ciechanover, A., Heller, H., Haas, A. L., Rose, I. A. Proposed role of ATP in protein breakdown: Conjugation of protein with multiple chains of the polypeptide of ATP-dependent proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (4), 1783-1786 (1980).
  11. Abdul Rehman, S. A., et al. Mindy-1 is a member of an evolutionarily conserved and structurally distinct new family of deubiquitinating enzymes. Mol Cell. 63 (1), 146-155 (2016).
  12. Storer, A. C., Ménard, R. Catalytic mechanism in papain family of cysteine peptidases. Methods Enzymol. 244, 486-500 (1994).
  13. Lange, S. M., Armstrong, L. A., Kulathu, Y. Deubiquitinases: From mechanisms to their inhibition by small molecules. Mol Cell. 82 (1), 15-29 (2022).
  14. Ndubaku, C., Tsui, V. Inhibiting the deubiquitinating enzymes (dubs). J Med Chem. 58 (4), 1581-1595 (2015).
  15. Schauer, N. J., Magin, R. S., Liu, X., Doherty, L. M., Buhrlage, S. J. Advances in discovering deubiquitinating enzyme (dub) inhibitors. J Med Chem. 63 (6), 2731-2750 (2020).
  16. Magin, R. S., et al. Small molecules as tools for functional assessment of deubiquitinating enzyme function. Cell Chem Biol. 28 (7), 1090-1100 (2021).
  17. Dang, L. C., Melandri, F. D., Stein, R. L. Kinetic and mechanistic studies on the hydrolysis of ubiquitin c-terminal 7-amido-4-methylcoumarin by deubiquitinating enzymes. Biochemistry. 37 (7), 1868-1879 (1998).
  18. Li, Y. T., et al. New semi-synthesis of ubiquitin c-terminal conjugate with 7-amino-4-methylcoumarin. J Pept Sci. 20 (2), 102-107 (2014).
  19. Feng, X., et al. Ubiquitination of UVRAG by SMURF1 promotes autophagosome maturation and inhibits hepatocellular carcinoma growth. Autophagy. 15 (7), 1130-1149 (2019).
  20. Qin, X., et al. Identification of an autoinhibitory, mitophagy-inducing peptide derived from the transmembrane domain of USP30. Autophagy. 18 (9), 2178-2197 (2022).
  21. Borodovsky, A., et al. Chemistry-based functional proteomics reveals novel members of the deubiquitinating enzyme family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  22. Ovaa, H. Active-site directed probes to report enzymatic action in the ubiquitin proteasome system. Nat Rev Cancer. 7 (8), 613-620 (2007).
  23. Ekkebus, R., Flierman, D., Geurink, P. P., Ovaa, H. Catching a dub in the act: Novel ubiquitin-based active site-directed probes. Curr Opin Chem Biol. 23, 63-70 (2014).
  24. D'arcy, P., et al. Inhibition of proteasome deubiquitinating activity as a new cancer therapy. Nat Med. 17 (12), 1636-1640 (2011).
  25. Sucher, N. J. The application of Chinese medicine to novel drug discovery. Expert Opin DrugDiscov. 8 (1), 21-34 (2013).
  26. Jung, I., Kim, H., Moon, S., Lee, H., Kim, B. Overview of salvia miltiorrhiza as a potential therapeutic agent for various diseases: An update on efficacy and mechanisms of action. Antioxidants (Basel). 9 (9), 857 (2020).
  27. Wang, Z., Peters, R. J. Tanshinones: Leading the way into lamiaceae labdane-related diterpenoid biosynthesis. Curr Opin Plant Biol. 66, 102189 (2022).
  28. Bai, M., et al. Astrocytes and microglia-targeted danshensu liposomes enhance the therapeutic effects on cerebral ischemia-reperfusion injury. J Control Release. 364, 473-489 (2023).
  29. Zhang, H., et al. Salvianolic acid a protects RPE cells against oxidative stress through activation of Nrf2/HO-1 signaling. Free Radic Biol Med. 69, 219-228 (2014).
  30. Wang, R., et al. Danshensu inhibits sars-cov-2 by targeting its main protease as a specific covalent inhibitor and discovery of bifunctional compounds eliciting antiviral and anti-inflammatory activity. Int J Biol Macromol. 257 (Pt 2), 128623 (2024).
  31. Misaghi, S., et al. Structure of the ubiquitin hydrolase UCH-L3 complexed with a suicide substrate. J Biol Chem. 280 (2), 1512-1520 (2005).
  32. Wing, S. S. Deubiquitinating enzymes--the importance of driving in reverse along the ubiquitin-proteasome pathway. Int J Biochem Cell Biol. 35 (5), 590-605 (2003).
  33. Samy, M. A., Abd El Fatah, N. M., Yahia, S. E., Arafa, R. K. Friend or foe: UCHL3 mediated carcinogenesis and current approaches in small molecule inhibitors' development. Curr Med Chem. 28 (42), 8782-8799 (2021).
  34. Hafez, N., Modather El-Awadly, Z., Arafa, R. K. UCH-L3 structure and function: Insights about a promising drug target. Eur J Med Chem. 227, 113970 (2022).
  35. Song, Z., et al. A novel UCHL(3) inhibitor, perifosine, enhances PARP inhibitor cytotoxicity through inhibition of homologous recombination-mediated DNA double strand break repair. Cell Death Dis. 10 (3), 398 (2019).
  36. Hirayama, K., Aoki, S., Nishikawa, K., Matsumoto, T., Wada, K. Identification of novel chemical inhibitors for ubiquitin c-terminal hydrolase-L3 by virtual screening. Bioorg Med Chem. 15 (21), 6810-6818 (2007).
  37. Nijman, S. M., et al. A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes. Cell. 123 (5), 773-786 (2005).
  38. Guo, M., et al. High-throughput screening for amyloid-β binding natural small-molecules based on the combinational use of biolayer interferometry and UHPLC-DAD-Q/TOF-MS/MS. Acta Pharm Sin B. 12 (4), 1723-1739 (2022).
  39. Chavanieu, A., Pugnière, M. Developments in spr fragment screening. Expert Opin Drug Discov. 11 (5), 489-499 (2016).
  40. Dai, L., et al. Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA). Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).
  41. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331 (2019).
  42. Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
  43. Fan, Z., Wang, S., Xu, C., Yang, J., Cui, B. Mechanisms of action of fu fang gang liu liquid in treating condyloma acuminatum by network pharmacology and experimental validation. BMC Complement Med Ther. 23 (1), 128 (2023).
  44. Tirat, A., et al. Synthesis and characterization of fluorescent ubiquitin derivatives as highly sensitive substrates for the deubiquitinating enzymes UCH-L3 and USP-2. Anal Biochem. 343 (2), 244-255 (2005).
  45. Hassiepen, U., et al. A sensitive fluorescence intensity assay for deubiquitinating proteases using ubiquitin-rhodamine110-glycine as substrate. Anal Biochem. 371 (2), 201-207 (2007).
  46. Chan, W. C., et al. Accelerating inhibitor discovery for deubiquitinating enzymes. Nat Commun. 14 (1), 686 (2023).
  47. Haj-Yahya, N., et al. Dehydroalanine-based diubiquitin activity probes. Org Lett. 16 (2), 540-543 (2014).
  48. Li, G., Liang, Q., Gong, P., Tencer, A. H., Zhuang, Z. Activity-based diubiquitin probes for elucidating the linkage specificity of deubiquitinating enzymes. Chem Commun (Camb). 50 (2), 216-218 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213UB AMCHA UB VS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved