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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das hier verwendete Experiment zeigt eine Methode des molekularen Andockens in Kombination mit Sondentechnologien, um die Interaktion zwischen kleinen Molekülen der traditionellen chinesischen Medizin und Proteinzielen vorherzusagen und zu validieren.

Zusammenfassung

Deubiquitinierende Enzyme (DUBs) spielen eine zentrale Rolle bei der Modulation der Ubiquitinierungshomöostase, wobei UCHL3 ein archetypisches Cystein-DUB ist, das an einer Vielzahl physiologischer und pathologischer Prozesse beteiligt ist. Daher ist die Entwicklung niedermolekularer Inhibitoren, die auf die Ubiquitin C-terminale Hydrolase L3 (UCHL3) abzielen, von großer Bedeutung. Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein Verfahren für das virtuelle Screening und die In-vitro-Validierung von niedermolekularen Inhibitoren von Cystein-DUB, repräsentiert durch UCHL3, zu etablieren. Zunächst werden potenzielle Inhibitoren von UCHL3 mittels molekularer Docking-Technologie virtuell gescreent und die Wechselwirkung zwischen Medikamenten und Proteinzielen sichtbar gemacht. Anschließend wird die Wirksamkeit des gescreenten Medikaments Danshensu durch In-vitro-Aktivitätshemmungsassays verifiziert. Ubiquitin-7-amino-4-methylcumarin (Ub-AMC) und Hämagglutinin-Ubiquitin-Vinylsulfon (HA-Ub-VS) werden als Sonden für In-vitro-Aktivitätstests verwendet, da sie kompetitiv mit niedermolekularen Inhibitoren an DUB binden können, um die Aktivität von UCHL3 zu beurteilen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Danshensu eine gute Bindungsaffinität zu UCHL3 beim molekularen Andocken aufweist und die Aktivität von UCHL3 mit HA-Ub-VS kompetitiv hemmen kann. Diese Ergebnisse liefern wichtige Referenzen für die weitere Forschung und Entwicklung von therapeutischen Medikamenten, die auf UCHL3 abzielen.

Einleitung

Die Ubiquitinierung ist eine posttranslationale Modifikation von Proteinen, ein Prozess, bei dem E1-Ubiquitin-aktivierende Enzyme, E2-Ubiquitin-konjugierende Enzyme und E3-Ubiquitin-Ligasen Ubiquitin an das Zielprotein binden, und der gesamte Prozess der Ubiquitinierung kann durch deubiquitinierende Enzyme (DUBs) umgekehrt werden1,2,3,4. Aufgrund ihrer wichtigen physiologischen und pathologischen Rolle gelten DUBs als wichtige Ziele für die Wirkstoffforschung 5,6.

Über 100 DUBs wurden beim Menschen identifiziert 7,8. Sie fungieren typischerweise als Isopeptidase, die für die Spaltung der Isopeptidbindung zwischen dem C-Terminus von Ubiquitin und einem Lysinrest in einem Substrat oder einem anderen Ubiquitinmolekül verantwortlichist 9,10. Derzeit werden sie hauptsächlich in sieben Hauptfamilien eingeteilt, nämlich: Ubiquitin-spezifische Peptidasen (USPs), Ovarialtumorproteasen (OTUs), Jab1/Mov34/Mpr1 Pad 1 N-terminale + Domänenproteasen (JAMMs), Motive, die mit Ubiquitin-haltigen neuartigen Proteasen der DUB-Familie (MINDYs) interagieren, Ubiquitin-C-terminale Hydroxylasen (UCHs), Machado-Josephin-Domänenproteasen (MJDs) und Zinkfinger-enthaltende Ubiquitin-Peptidase 1 (ZUP1)9. Neben JAMMs, die zur Zinkmetalloprotease-Familie11 gehören, handelt es sich bei den anderen DUBs um Cysteinproteasen, die durch eine katalytische Triade gekennzeichnet sind, die aus katalytischem Cystein, Histidin und einem dritten sauren Rest12,13 besteht. Diese Spezifität eröffnet Wege für die Entwicklung niedermolekularer Inhibitoren, die auf das aktive Zentrum des Enzyms oder auf nahe gelegene allosterische Taschen abzielen.

Auf dem Gebiet der Deubiquitinierungsenzymforschung besteht eine große Herausforderung bei der Charakterisierung ihrer Aktivität14,15. Die Charakterisierung anhand aktiver Sonden dient als entscheidender Ansatz für die Untersuchung von DUB-Inhibitoren16. Durch die Durchführung kompetitiver Assays mit aktivitätsbasierten Sonden und Inhibitoren in Zelllysaten oder rekombinanten Proteinen kann die Aktivität von DUBs charakterisiert werden, was die Entwicklung von niedermolekularen Inhibitoren erleichtert, die auf diese Enzyme abzielen. Ub-AMC ist eine frühe Sonde zum Nachweis der DUB-Aktivität, bei der eine Fluoreszenzgruppe an das C-terminale Ende des Ubiquitins17,18 angehängt ist. Wenn DUBs ihre katalytische Aktivität ausüben, wird AMC in großen Mengen freigesetzt und die Fluoreszenzintensität des detektierten Lichts entsprechend erhöht. Diese Sonde wird häufig im Hochdurchsatz-Screening von DUB-Inhibitoren eingesetzt 19,20. Die Sonde HA-Ub-VS wird auch zur Messung der DUB-Aktivität21 verwendet. Es hat eine Vinylsulfongruppe am C-Terminus von Ubiquitin, was es zu einem Selbstmordsubstrat für DUBs macht. Nach der Trennung von Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) können aktive DUBs mit Western Blotting 22,23,24 nachgewiesen werden.

In der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) werden seit mehr als 2000 Jahren Heilpflanzen eingesetzt. Die Entwicklung neuer Medikamente aus Naturstoffen ist von großer medizinischer Bedeutung, wobei der Schwerpunkt auf der Identifizierung von Wirkstoffen und der Aufklärung ihrer Mechanismen liegt25. Salvia miltiorrhiza Bge ist ein Kraut, das häufig bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt wird, darunter Krebs, Herz-Kreislauf-, Leber- und neurologischeKrankheiten 26. Derzeit enthält es bekannte kleine Moleküle wie Tanshinon27, Danshensu28, Tanshininsäure29 usw. Diese Verbindungen weisen vielfältige biologische Aktivitäten auf, wie z. B. antithrombotische, antioxidative und antitumorale Wirkungen, was sie für die Forschung sehr wertvoll macht26. Neuere Studien haben Danshensu als kovalenten Inhibitor der 3-Chymotrypsin-ähnlichen Protease (3CLpro) von SARS-CoV-2identifiziert 30. Es wurde gezeigt, dass es eine kovalente Bindung mit dem aktiven Zentrumsrest C145 von 3CLpro eingeht, was auf das Vorhandensein potenzieller niedermolekularer Proteaseinhibitoren in Salvia miltiorrhiza Bge hinweist.

Die Ubiquitin C-terminale Hydrolase L3 (UCHL3) gehört zu den Cysteinproteasen innerhalb der UCH-Familie der DUBs. Es stützt sich auf konservierte Reste wie Cystein95, Histidin169 und Asparaginsäure184, um seine Funktionen effektiv zu katalysieren31,32. Es spielt eine entscheidende Rolle in mehreren molekularen Signalwegen, einschließlich des Zellzyklus, der homologen Rekombination und der Reparatur von proteingebundenen DNA-Brüchen33. Darüber hinaus ist es bei verschiedenen Krebsarten wie Eierstock-, Prostata-, Bauchspeicheldrüsen-, Darm- und nicht-kleinzelligem Lungenkrebs hochreguliert34. Basierend auf diesen Studien scheint UCHL3 ein vielversprechendes Ziel für die Behandlung von Krankheiten zu sein. Mehrere niedermolekulare Inhibitoren von UCHL3 wurden identifiziert und befinden sich auf dem Weg zum klinischen Einsatz 35,36.

In dieser Studie wurde molekulares Docking durchgeführt, um Wechselwirkungen zwischen kleinen Molekülen aus Salvia miltiorrhiza Bge und UCHL3 zu untersuchen. Anschließend wurde Danshensu in einem In-vitro-Experiment mit den DUB-spezifischen Sonden Ub-AMC und HA-Ub-VS als niedermolekularer Inhibitor von UCHL3 identifiziert. Das molekulare Andocken sagte auch potenzielle Bindungsstellen für Danshensu voraus, was auf seinen Wirkmechanismus hindeutet.

Protokoll

1. Herunterladen der Strukturen kleiner Moleküle von Salvia miltiorrhiza Bge und UCHL3

  1. Laden Sie die Datei mit kleinen Molekülen herunter.
    1. Öffnen Sie die TCMSP-Datenbank (https://old.tcmsp-e.com), geben Sie danshen (Kräutername) ein, drücken Sie dann auf "Suchen " und klicken Sie auf das Radix Salviae in der Ergebnisliste.
    2. Klicken Sie auf Download für eines der Elemente und speichern Sie die 2D-Struktur im .mol2-Format.
  2. Laden Sie die Proteindatei herunter.
    1. Öffnen Sie die PDB-Datenbank (https://www.rcsb.org/), geben Sie UCHL3 ein, und drücken Sie dann auf Suchen. Klicken Sie auf Homo sapiens und drücken Sie dann in Verfeinerungen auf Suchen .
    2. Wählen Sie die Struktur 1XD3 mit Kokristallisation kleiner Moleküle, klicken Sie dann auf Dateien herunterladen und wählen Sie das PDB-Format aus.

2. Molekulares Andocken

  1. Speichern Sie die Datei.
    1. Erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Namen danshen_UCHL3 docking auf dem Desktop und speichern Sie in diesem Ordner die Verbindungen der Strukturen Salvia miltiorrhiza , Bge und UCHL3. Benennen Sie den Ordner auf Englisch. Andernfalls kann die Datei nicht importiert werden.
  2. Legen Sie den Pfad fest.
    1. Öffnen Sie die Maestro-Software, klicken Sie auf Datei, wählen Sie Arbeitsverzeichnis ändern, klicken Sie auf Desktop, doppelklicken Sie, um den danshen_CUHL3 Docking-Ordner auszuwählen, und klicken Sie auf Optionen auswählen.
  3. Verarbeitung kleiner Moleküle
    1. Importieren Sie kleine Molekülstrukturen.
      1. Klicken Sie auf die Optionen Datei und Importstrukturen. Klicken Sie auf Desktop, doppelklicken Sie auf den Docking-Ordner und klicken Sie auf die Strukturdatei Salvia miltiorrhiza Bge. Klicken Sie dann auf Öffnen, um alle kleinen Moleküle zu importieren.
    2. Bereiten Sie das kleine Molekül vor.
      1. Klicken Sie auf Aufgaben und wählen Sie die Option LigPrep aus. Klicken Sie im angezeigten LigPrep-Fenster auf die Projekttabelle mit der Option Struktur verwenden von , aktivieren Sie die Option Chiralitäten aus 3D-Struktur bestimmen unter Berechnung und belassen Sie alle anderen Softwareeinstellungen als Standardeinstellungen.
      2. Ändern Sie den Auftragsnamen in danshen_ligprep1, und klicken Sie dann auf Ausführen , um die Verarbeitung kleiner Moleküle auszuführen.
  4. Verarbeitung der Proteinstruktur
    1. Importieren Sie die Proteinstruktur.
      1. Klicken Sie auf die Optionen Datei - und Importstrukturen, klicken Sie auf Desktop und doppelklicken Sie auf den danshen_CUHL3 Docking-Ordner.
      2. Klicken Sie auf die UCHL3-Proteinstrukturdatei , und klicken Sie dann auf Öffnen , um die Proteinstrukturdatei zu importieren.
    2. Bereite das Protein vor.
      1. Wählen Sie die beiden kovalenten Bindungen aus, die UCHL3 und das kleine Molekül verbinden, und löschen Sie sie mit der Schaltfläche Löschen . Wählen Sie dann die beiden Proteinreste aus, die nach der Deletion unvollständig sind. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erstellen , wählen Sie Andere Bearbeitungen aus, und klicken Sie dann für Gly75 auf die Schaltfläche C , für Cys95 wählen Sie Mutate Residue und CYS aus.
      2. Klicken Sie auf Aufgaben und wählen Sie die Option Workflow für die Proteinzubereitung aus. Behalten Sie alle anderen Softwareeinstellungen als Standard bei. Ändern Sie den Auftragsnamen in UCHL3_protein pre und klicken Sie dann auf Ausführen , um die Proteinverarbeitung durchzuführen.
    3. Richten Sie die Dockingbox ein.
      1. Klicken Sie auf Aufgaben, wählen Sie Rezeptorgittergenerierung und wählen Sie Auswahl, um das Ligandenmolekül zu identifizieren . Wählen Sie das kleine Molekül in der Arbeitsfläche e aus, und es erscheint eine rosa Andockbox, die auf den Koordinaten der kleinen Moleküle zentriert ist.
      2. Behalten Sie die Standardeinstellungen bei, benennen Sie den Auftrag als 1XD3_danshen_glide_grid, und klicken Sie dann auf Ausführen.
        HINWEIS: In 1XD3 geht das kleine Molekül eine kovalente Bindung mit dem Protein ein. Es ist notwendig, diese kovalente Bindung zu entfernen, um das kleine Molekül vom Protein zu trennen. Andernfalls kann das kleine Molekül während des Aufbaus des Rezeptorgitters nicht ausgewählt werden.
  5. Führen Sie molekulares Andocken durch.
    1. Klicken Sie auf Aufgaben und wählen Sie die Option Liganden-Docking . Wählen Sie das Receptor Grid aus, klicken Sie auf Aus Datei und dann auf Durchsuchen. Wählen Sie 1XD3_danshen_glide_grid.zip Datei aus, und klicken Sie dann auf Öffnen.
    2. Klicken Sie auf Liganden aus Dateien verwenden und dann auf Durchsuchen. Klicken Sie auf danshen_ligprep1 Datei, wählen Sie danshen_ligprep1-out. maegz-Datei aus, und klicken Sie dann auf Öffnen.
    3. Klicken Sie auf Einstellungen , wählen Sie die Option Genauigkeit als SP aus, ändern Sie den Auftragsnamen in danshen_UCHL3_ glidedock _SP, und klicken Sie auf Ausführen.
  6. Zeigen Sie die Andockergebnisse an.
    1. Klicken Sie auf die Optionen Datei und Importstrukturen . Klicken Sie auf Desktop und doppelklicken Sie auf den danshen_CUHL3 Docking-Ordner.
    2. Doppelklicken Sie auf die Datei danshen_UCHL3_ glidedock _SP , klicken Sie auf die Datei danshen_UCHL3_ glidedock _SP_pv.maegz , und klicken Sie dann auf Öffnen.
    3. Klicken Sie auf die Option Tabelle , und zeigen Sie dann die Punktzahl unter Andockpunktzahl an.
  7. Visualisieren Sie die Wechselwirkungen zwischen Danshensu und UCHL3.
    1. Doppelklicken Sie auf die Datei danshen_UCHL3_glidedock _SP_pv.maegz und öffnen Sie sie in Maestro. Halten Sie in der Eintragsliste die Umschalttaste gedrückt und wählen Sie gleichzeitig Danshensu und das Protein aus.
    2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Zusammenführen , um eine neue Struktur zu erstellen. Wählen Sie die neue Struktur aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Exportieren aus, klicken Sie dann auf Strukturen, benennen Sie die Datei danshensu_UCHL3, und exportieren Sie sie im PDB-Format.
    3. Wählen Sie die Zusammenführungsstruktur im Bedienfeld aus, klicken Sie auf Aufgaben, wählen Sie 2D-Skizze aus, und erhalten Sie ein 2D-Strukturbild der Interaktion zwischen danshensu und UCHL3.
    4. Importieren Sie die Datei danshensu_UCHL3.pdb in die pymol-Software und visualisieren Sie sie basierend auf der von Maestro erhaltenen 2D-Struktur.

3. Reinigung des Proteins UCHL3

  1. Aufbau des prokaryotischen Expressionsplasmids pHUE-UCHL3
    1. Beziehen Sie die kodierende Sequenz des rekombinanten Proteins UCHL3-Gens von NCBI (isform2). Integrieren Sie das erhaltene Genfragment über homologe Rekombination in den pHUE-10HIS-Vektor und transformieren Sie es in DH5α-kompetente Zellen. Extrahieren Sie die Plasmid-DNA, um das gewünschte Konstrukt zu erhalten.
  2. Induktion und Aufreinigung rekombinanter Proteine
    1. Bakterienkultur:
      1. Transformieren Sie die rekombinanten Plasmide in BL21 (DE3) kompetente Zellen und verteilen Sie sie auf Luria-Bertani (LB) Agarplatten, die Ampicillin enthalten. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C.
      2. Entnehmen Sie einzelne Kolonien, impfen Sie sie in 12 ml flüssiges LB-Medium, das mit 50 μg/ml Ampicillin versetzt ist, und kultivieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
    2. Transformation und Einarbeitung
      1. Verdünnen Sie die Bakterienkultur über Nacht mit einem frischen Medium auf 2 %. Wenn OD600 0,4-0,6 erreichte, fügen Sie Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 0,4 mM hinzu, um eine Niedertemperaturinduktion bei 16 °C für 12 h durchzuführen.
    3. Entnahme von Bakterienkulturen
      1. Die Bakterienkultur in sterile Zentrifugenröhrchen überführen und bei 2200 x g für 10 min zentrifugieren. Den Überstand entfernen und die Stämme zur Konservierung bei -80 °C lagern.
    4. Sonorisierung
      1. Resuspendieren Sie den Stamm in 25 mL (1/20 der gesammelten Bakterienkultur) Puffer 1 (50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA). Führen Sie die bakterielle Beschallung unter folgenden Bedingungen durch: ein für 4 s, aus für 6 s, eine Energie von 60 % für 15 min. 1% Triton X-100 zugeben und bei 4 °C 30-60 min lysieren.
    5. Trennung von Überstand und Pellet
      1. Die Probe wird bei 9000 x g bei 4 °C 30 min lang zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand und filtrieren Sie ihn durch einen 0,45 μm Membranfilter. 50 μl des Überstands als Eingang reservieren.
      2. Resuspendieren Sie das Pellet in Puffer 1, fügen Sie eine angemessene Menge von 5x Probenpuffer hinzu (25 % 1 M Tris-HCl [pH 6,8], 10 % Natriumdodecylsulfat, 0,5 % Bromphenolblau, 41,67 % Glycerin und 10 % DL-Dithiothreitol) und kochen Sie es 10 min lang bei 100 °C.
  3. Protein-Aufreinigung
    1. Säulen-Äquilibrierung
      1. Laden Sie 1 ml NiNTA-Nickelharz in die Säule, lassen Sie es 10 Minuten lang absetzen und äquilibrieren Sie dann die Säule nacheinander mit 5 Säulenvolumina Puffer 2 (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl), der 10 mM, 500 mM und 10 mM Imidazol enthält.
      2. Verwenden Sie eine Pipette, um 5 ml (ca. 5 Säulenvolumen) der 10 mM Imidazollösung entlang der Wand der Säule hinzuzufügen. Führen Sie diesen Vorgang durch, ohne die Durchflussmenge zu steuern.
      3. Sobald die Flüssigkeit das Packungsmaterial bedeckt und fast abgelassen ist, fügen Sie nacheinander 5 Säulenvolumina der 500 mM Imidazollösung und der 10 mM Imidazollösung zur Äquilibrierung hinzu. Wenn die restlichen 10 mM Imidazollösung das Packungsmaterial gerade noch bedeckt, schließen Sie den Durchflussregler, um den Ausgleich zu stoppen.
    2. Protein-Aufreinigung
      1. Der gefilterte Proteinüberstand wird mit einer Flussrate von 0,5 ml/min (<15 s pro Tropfen) durch die Säule geleitet und die Durchflussfraktion aufgefangen. Bereiten Sie einen Konzentrationsgradienten von 10 mM, 30 mM, 50 mM und 100 mM Imidazol unter Verwendung von Puffer 2 zusammen mit 0,5 M NaCl vor.
      2. Eluieren Sie sequentiell von niedrigen zu hohen Konzentrationen von Imidazol, indem Sie mit einer Pipette etwa 5 Säulenvolumina der Lösung entlang der Säulenwand hinzufügen, ohne die Flussrate zu kontrollieren. Sammeln Sie das Eluat in sauberen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und führen Sie einen Durchfluss von 1 ml pro Röhrchen durch.
      3. Nachdem Sie fünf Röhrchen entnommen haben, entnehmen Sie 1 μl Durchfluss aus jedem Röhrchen, um mit 1 μl Bradford-Puffer zu reagieren. Wenn die Reaktion blau bleibt, fahren Sie mit den Schritten fort. Wenn es transparent wird, stoppen Sie die Elution bei dieser Konzentration und wechseln Sie zur nächsten.
      4. Nach der Eluierung mit 100 mM Imidazol mit 10 Säulenvolumina von 0,5 M NaCl waschen, ohne die Flussrate zu kontrollieren oder das Eluat zu sammeln.
      5. Zum Schluss eluieren Sie mit 500 mM Imidazol (<15 s pro Tropfen). Geben Sie mit einer Pipette 1 ml der Lösung in die Säule und behalten Sie dabei die oben erwähnte langsame Elutionsrate bei. Sammeln Sie 1 ml des Eluats mit einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und wiederholen Sie diesen Vorgang 10 Mal.
    3. Beurteilen Sie das gereinigte Protein mit der Coomassie Brilliant Blue-Färbung.
      1. Quantifizieren Sie das zuvor erhaltene Pellet, den Vorreinigungsüberstand und die gesammelten 10 Proteinröhrchen, indem Sie 10 μl aus jeder Gruppe entnehmen, den entsprechenden 5x Probenpuffer hinzufügen und dann 5 Minuten lang auf 100 °C erhitzen.
      2. Bereiten Sie die Rinderserumalbumin (BSA)-Standardlösung in einer Menge von 1 mg/ml, 500 μg/ml und 100 μg/ml vor. Anschließend den passenden 5x Probenpuffer zugeben und 5 min bei 100 °C erhitzen.
      3. Führen Sie eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese an den Proben durch, entfernen Sie dann das Gel und inkubieren Sie es über Nacht bei Raumtemperatur (RT) in Coomassie Brilliant Blue-Lösung auf einem Schüttler mit niedriger Geschwindigkeit.
      4. Am nächsten Tag geben Sie das Gel zur Entfärbung in eine Entfärbungslösung (40 % Ethanol, 10 % Essigsäure, 50 % H2O) und wenden dabei bei Bedarf sanfte Hitze an. Sobald das Gel transparent ist, beobachten Sie es unter einem Entwicklungsinstrument, um das gereinigte Protein basierend auf BSA-Werten zu quantifizieren und die Reinheit zu beurteilen, indem Sie auf eine einzelne Bande prüfen.
    4. Proteinlagerung: Aliquotieren Sie das Protein in Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 μl pro Röhrchen, frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bei -80 °C.

4. UCHL3-Aktivitätsassay (Ub-AMC-Assay)

  1. Proteinzubereitung
    1. Tauen Sie das Protein auf Eis auf, zentrifugieren Sie die Probe bei 1000 x g bei RT für 3 min und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der BCA-Methode. Verdünnen Sie das Protein mit Puffer 1 auf eine Konzentration von 40 nM.
  2. Einrichten von Gruppen
    1. Legen Sie Puffer 1 als Kontrollgruppe und UCHL3 als experimentelle Gruppe fest. Geben Sie 200 μl jeder Probe pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte und richten Sie 3 Replikate pro Gruppe ein.
  3. Erkennung
    1. Kurz vor der Messung schnell Ub-AMC in jede Vertiefung geben und 2-5 s kräftig schütteln. Die Konzentration von Ub-AMC beträgt 250 nM. Messen Sie Außendurchmesserwerte bei 380 nm Anregungswellenlänge und 460 nm Emissionswellenlänge unter 37 °C-Bedingungen, wobei Sie bis zu 10 Minuten lang alle 30 s Messungen vornehmen.

5. Inhibitionsassay der UCHL3-Aktivität mittels HA-Ub-VS (HA-Ub-VS-Assay)

  1. Proteinzubereitung
    1. Tauen Sie das Protein auf Eis auf, zentrifugieren Sie die Probe bei 1000 x g bei RT für 3 min und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der BCA-Methode. Verdünnen Sie das Protein auf eine Konzentration von 10 μg/ml.
  2. Präparation von kleinen Molekülen
    1. Wiegen Sie Danshensu und verdünnen Sie es in einem Gradienten mit hochreinem Wasser auf 5 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM und 1 μM.
  3. Einrichten von Gruppen
    1. Richten Sie die reine Proteingruppe und die Gruppe ohne niedermolekulare Wirkstoffe als negative Kontrollgruppen ein. Verwenden Sie PR619 (DUB-Inhibitor) als positive Kontrollgruppe und die anderen Gruppen als niedermolekulare Arzneimittelbehandlungsgruppen.
  4. Probenvorbereitung
    1. Gemäß der Gruppierung werden nacheinander 9 μl UCHL3 und 1 μl Dansensu in den entsprechenden Konzentrationen zu jeder arzneimittelbehandelten Gruppe hinzugefügt. Geben Sie 1 μl PR619 (50 μM in Gebrauch) in die Positivkontrollgruppe. Verwenden Sie hochreines Wasser und Puffer 1, um die Negativkontrollgruppe auszugleichen.
    2. Gründlich durch Vortexen mischen und bei 37 °C 30 min inkubieren. Die Reaktionsproben auf Eis legen, HA-Ub-VS bis zu einer Endkonzentration von 1 μM zugeben, durch Vortexen gründlich mischen und 30 min bei 37 °C inkubieren.
    3. Eine angemessene Menge von 5x Probenpuffer zugeben und in einem 100 °C Metallbad 10 min erhitzen. Geben Sie die Proben für 5 min bei RT und laden Sie sie auf das Gel.

6. Westlicher Blot

  1. Vorbereitung des SDS-PAGE-Gels
    1. Spülen Sie einen Satz Glasscheiben mit Reinstwasser ab. Legen Sie die Platten in den Klemmschlitz und dann auf eine Klarsichtplatte. Reinstwasser zugeben und 10 Minuten lang auf Dichtheit prüfen.
    2. Bereiten Sie den Trennkleber entsprechend der Leimabgabetabelle vor.
    3. Gießen Sie das hochreine Wasser aus der Gelkassette und nehmen Sie das restliche Wasser mit Filterpapier auf. Zügig und gleichmäßig das vorbereitete 12%ige Trenngel zugeben. Fügen Sie dann 1 ml Isopropanol hinzu und warten Sie ca. 30 Minuten, bis sich das Gel verfestigt.
    4. Bereiten Sie die oberste Schicht aus konzentriertem Klebstoff gemäß der Leimabgabetabelle vor.
    5. Entfernen Sie das Isopropanol von der Oberseite des Trenngels, waschen Sie es 3 Mal mit hochreinem Wasser und tupfen Sie es mit Filterpapier trocken. Geben Sie schnell das vorbereitete 3%ige Stapelgel hinzu, führen Sie einen 1,0 mm 15-Loch-Kamm ein und warten Sie ca. 30 Minuten.
      HINWEIS: Halten Sie den Kamm senkrecht zur Klebeoberfläche und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen entstehen.
  2. Elektrophorese
    1. Entfernen Sie den Kamm senkrecht und gießen Sie eine ausreichende Menge Laufpuffer in die innere Kammer des Elektrophoresegeräts, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit die Probenvertiefungen bedeckt.
    2. Den Proteinmarker und die vorbereiteten Versuchsproben auf RT legen, gründlich vortexen und kurz zentrifugieren. Geben Sie 3 μl Proteinmarker in die erste Vertiefung der linken Probe, gefolgt von 10 μl der experimentellen Probe in jede weitere Vertiefung.
    3. Geben Sie eine angemessene Menge Laufpuffer in die äußere Kammer des Elektrophoresetanks, decken Sie den Tank mit seinem Deckel ab und schließen Sie die Stromversorgung an. Stellen Sie sicher, dass das Netzteil richtig angeschlossen ist.
    4. Schalten Sie die Stromversorgung ein und stellen Sie die Spannung auf 80 V ein, bis sich die Proben in Leitungen konzentrieren, und erhöhen Sie dann die Spannung auf 120 V, sobald die Trennung im Trenngel beginnt.
      HINWEIS: Achten Sie während des Vorgangs darauf, dass sich keine Blasen an der Unterseite bilden. Wenn Blasen auftreten, kippen Sie das Elektrophoresegerät zur Seite, um sie auszustoßen.
  3. Übertragung auf Membran
    1. Hebeln Sie die Gelkassette mit einem Plastikmesser auf. Schneiden Sie oben links eine Ecke ab, an der die Probenladung begann, um die Ausrichtung zu markieren. Das Gel und das benötigte Filterpapier 1-2 min im Transferpuffer einweichen.
    2. Messen und schneiden Sie die Membran aus Polyvinylidendifluorid (PVDF) entsprechend der für das Zielprotein erforderlichen Größe. Aktivieren Sie die PVDF-Membran, indem Sie sie 20 s bis 1 min in Methanol einweichen und dann mit dem Gel in den Transferpuffer tauchen.
    3. Gießen Sie eine kleine Menge Transferpuffer in die Transfervorrichtung und befeuchten Sie die halbtrockene Transfereinheit mit einer Walze. Ordnen Sie die Komponenten in der folgenden Reihenfolge von unten nach oben an: drei Schichten Filterpapier, Gel, PVDF-Membran und drei weitere Schichten Filterpapier.
    4. Nachdem Sie jede Schicht aufgetragen haben, verwenden Sie die Rolle, um Blasen zu entfernen. Befeuchten Sie den Deckel mit Transferpuffer und decken Sie dann das Gerät ab.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass eine ausreichende Menge an Transferpuffer vorhanden ist, und fügen Sie nach Abschluss jeder Schicht eine kleine Menge hinzu. Bereiten Sie im Voraus Markierungen vor, die zwischen der linken und rechten Seite des Gels unterscheiden, auf die die Proben geladen wurden, sowie die Vorder- und Rückseite der Membran identifizieren. Nachdem jede Schicht aufgetragen wurde, rollen Sie vorsichtig, um Blasen zu entfernen.
    5. Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie die richtige Polarität sicher. Stellen Sie den Strom auf 190 mA ein und stellen Sie die Zeit auf 45 min ein.
  4. Blockierend
    1. Bereiten Sie eine 5%ige fettfreie Trockenmilchlösung in TBST (1% Tween20) als Blockierungspuffer vor. Legen Sie die PVDF-Membran mit der Vorderseite nach oben in eine Hybridisierungsbox, gießen Sie 10 ml Blockierungspuffer hinein und schütteln Sie sie vorsichtig auf einem Schüttler mit niedriger Geschwindigkeit bei RT für 1 h, um zu blockieren.
  5. Inkubation des Primärantikörpers
    1. Bereiten Sie den Primärantikörper mit Antikörperlösung1 bei 1:1000 vor und geben Sie 10 ml Primärantikörper in die neue Inkubationsbox. Stellen Sie die Inkubationsbox in einen 4 °C kalten Raum und bewahren Sie sie über Nacht auf einem Shaker auf.
  6. Inkubation des Sekundärantikörpers
    1. Sammeln Sie den primären Antikörper am nächsten Tag in der Inkubationsbox, fügen Sie dann die richtige TBST-Lösung hinzu und legen Sie sie zum Waschen 5 Minuten lang auf einen Shaker, wiederholen Sie dies 3 Mal.
    2. Bereiten Sie den Sekundärantikörper mit 5%iger Milchlösung bei 1:5000 vor. Geben Sie 1 ml des Sekundärantikörpers auf den Boden einer angefeuchteten Hybridisierungsbox. Platzieren Sie die PVDF-Membran mit der Proteinseite nach unten auf dem Sekundärantikörper und inkubieren Sie dann 1,5 Stunden lang bei RT auf einem Schüttler mit niedriger Geschwindigkeit.
    3. Fügen Sie die richtige TBST-Lösung hinzu und geben Sie sie zum Waschen 5 Minuten lang auf einen Shaker; 3 Mal wiederholen.
  7. Belichten der Streifen
    1. Nehmen Sie gleiche Mengen der Chemilumineszenz-Reagenzien A und B, schütteln Sie sie und mischen Sie sie gut. Schirmen Sie die Lösung vor Licht ab.
    2. Tragen Sie die Entwicklungslösung gleichmäßig auf die PVDF-Membran auf und schütteln Sie sie leicht, um sicherzustellen, dass die Membran gleichmäßig mit der Lösung bedeckt ist.
    3. Setzen Sie die Membran in das Gel-Imaging-System ein und stellen Sie die Belichtungszeit, die Anzahl der Aufnahmen und andere relevante Parameter ein.
      HINWEIS: Der Entwickler muss den Streifen vollständig abdecken, und die Entwicklung sollte sich in einer dunklen Umgebung befinden.

Ergebnisse

Um die kleinen Moleküle in der Salvia miltiorrhiza Bge herauszufiltern, die UCHL3 effektiv hemmen können, haben wir ein molekulares Andocken zwischen den kleinen Molekülen aus der TCMSP-Website mit UCHL3 durchgeführt. Die Top 30 der kleinen Moleküle in den Andockergebnissen und ihre Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Andockergebnisse für alle kleinen Moleküle sind in der ergänzenden Tabelle 1 dargestellt. Wir wählten Danshens...

Diskussion

DUBs spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Homöostase des gesamten Ubiquitin-Systems, indem sie Ubiquitin von Substraten oder Polyubiquitinketten entfernen37. In den letzten Jahren haben diese Enzyme auch als Angriffspunkte für die Medikamentenentwicklung viel Aufmerksamkeit erregt13. Bei der Entwicklung niedermolekularer Wirkstoffe gibt es jedoch Herausforderungen. So führt beispielsweise ein Hochdurchsatz-Screening m...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of Beijing [Fördernummer 7244498] unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
30% AcrylamideBeijing Lablead Biotech Co., LtdA3291
Ammonium persulfateChina National Medicines Corporation Ltd10002616
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074Cell Signaling Technology7074P2
BeyoECL PlusBeyotimeP0018S
Bradford Protein Assay KitBeyotimeP0006
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115-01
DanshensuShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB20254
DMSOAmeresco, Inc.21K2356571
Electrophoresis SystemLiuyi Biotechnology112-0630
HEPESSigmaH3375
His-tagged protein purification kit (NTA-Ni agarose magnetic beads)BeyotimeP2247S
Immun-Blot PVDF Membrane, Roll, 26 cm x 3.3 mBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1620177
Isopropyl alcoholMacklinI811925
M5 Prestained Protein LadderMei5 Biotechnology Co.LtdMF-212-01
MaestroSchrödinger’shttps://www.schrodinger.com/platform/products/maestro/
Methyl alcoholChina National Medicines Corporation Ltd10014108
MF-MilliporeMilliporeHAWP04700
MyFug mini centrifugeSigmaZ764183
Pierce Dilution-Free Rapid Gold BCA Protein AssayThermo ScientificA55860
PR-619Cell Signaling Technology26065S
Primary Antibody Dilution Buffer for Western BlotMacklinP917820
Recombinant Human HA-Ubiquitin Vinyl Sulfone Protein, CFR&D SystemsU-212-025
Recombinant Human Ubiquitin AMC Protein, CFR&D SystemsU-550-050
Skim MilkBecton,Dickinson and Company232100
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Ameresco, Inc.205-788-1
TEMEDAmeresco, Inc.2545C134
Tween 20Beijing Lablead Biotech Co., Ltd0777-1
UCHL3 (D25E6) Rabbit mAbCell Signaling Technology8141T

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