用于研究 结核分枝杆菌 与免疫受体 SLAMF1 相互作用的荧光检测

摘要

本研究为评估 结核分枝杆菌 与 SLAMF1 微生物传感器的相互作用提供了一种方案。使用流式细胞术和荧光显微镜对人单核细胞衍生的巨噬细胞进行检测。所描述的工具与研究病原体和免疫受体之间的相互作用有关。

摘要

对病原体和免疫受体之间直接相互作用的评估通常涉及复杂的技术，或者意味着使用转基因菌株和基因工程细胞。在这里，描述了一种检测巨噬细胞微生物传感器 SLAMF1 和 结核分枝杆菌 之间生化相互作用的替代方法。开发了两种采用流式细胞术和荧光显微镜的技术方法。从人巨噬细胞中生成总细胞蛋白提取物，然后在 4°C 下与 结核分 枝杆菌 （WCMtb） 或 结核分 枝杆菌抗原 （Mtb Ags） 全细胞孵育过夜，最后使用甲醛/甘氨酸/乙二醇双（琥珀酰亚胺琥珀酸酯）处理交联。 用 PE 特异性抗 SLAMF1 抗体检测流式细胞术与 WCMtb 的相互作用。通过将罗丹明-PE 染色的 Mtb Ags 附着到聚-D-赖氨酸包被的载玻片上，将其与来自单核细胞衍生的巨噬细胞的总蛋白提取物一起孵育，通过荧光显微镜进行相互作用的存在。交联处理后，使用一抗 （抗 SLAMF1） 和二抗 （Alexa Fluor 488） 对 SLAMF1 进行可视化。这些检测为测量病原体-免疫受体相互作用提供了一种强大的生化工具，克服了与转基因细胞系和蛋白质基因表达调节实验相关的困难。

引言

结核分枝杆菌是 142 年前发现的结核病致病病原体，仍然是一项全球性挑战，目前至少感染了世界人口的四分之一¹。结核分枝杆菌通过感染者的空气飞沫传播，到达肺部的肺泡巨噬细胞，在那里它可以在潜伏状态下长期存活 ^2,3。不仅局部巨噬细胞反应被激活，而且近年来，据描述外周单核细胞可以被募集到呼吸道并分化为肺泡巨噬细胞，从而产生比胎儿来源的结核分枝杆菌更强烈的反应 ^2,4。

巨噬细胞是先天免疫的基本参与者。摄入结核分枝杆菌后，巨噬细胞表现出许多杀微生物功能，例如分泌促炎细胞因子、吞噬溶酶体融合以及激活其他免疫细胞以杀死结核分枝杆菌 ^2,3。然而，这种病原体的复杂结构提供了能够调节巨噬细胞代谢和功能的效应子（例如蛋白质和脂质），从而调节炎症过程³。这种通过分泌毒力因子或利用宿主因子来纵巨噬细胞反应，导致结核分枝杆菌施加不同的逃逸策略。一些关键的逃避机制包括诱导抗炎细胞因子、抑制吞噬溶酶体成熟和酸化、氧化应激改变、自噬破坏以及抗原加工和呈递过程中的缺陷 ^3,5。

巨噬细胞和结核分枝杆菌之间受到严格调节的相互作用对于适当免疫反应的发展至关重要。因此，研究这些突触是识别宿主-病原体串扰诱导的免疫保护或免疫致病机制以及确定潜在治疗靶点的关键。许多受体介导结核分枝杆菌的识别和/或内化，包括 TLR ^6,7,8、NLR7、⁸、补体受体 ^6,8、C 型凝集素受体 ^6,8 和清道夫受体 ^6,8.积累的数据表明，表面结合和细胞内 PRR 在感染过程中都起着重要作用，识别调理素和非调理素结核分枝杆菌。

Zihad 和 Sifat 等人最近回顾了 PRR 参与结核分枝杆菌诱导的先天细胞反应⁹。特别是，TLR 家族的大多数成员都与结核分枝杆菌配体的相互作用有关 ^6,7。表面 TLR2 识别分枝杆菌抗原，例如酰化脂蛋白、19-kDa 脂蛋白、LprA 脂蛋白、LprG 脂蛋白、30-kDa 抗原、38-kDa 抗原、MymA、脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸 （PPE）-57、LAM、LM、PIM、热休克蛋白 60、特征蛋白 Rv1509 和分泌蛋白 ESAT-6⁷。膜 TLR4 与热休克蛋白、38-kDa 抗原、RpfE、Rv0652、Rv0335c、Rv2659c、Rv1738、Rv2627c、Rv2628、GrpE 和 HBHA 相互作用。另一方面，内体 TLR 的配体（TLR 3、7、8 和 9）包括结核分枝杆菌的 dsRNA、tRNA、ssRNA、吞噬体 RNA 和 dsDNA。此外，当与 TLR1 和 TLR6、TLR4 和 TLR9 联合作用时，TLR2 在启动免疫应答中起积极作用 ^6,7。NOD2 和 NLRP3 是结核病中特征最明确的细胞质 NLR。尽管它们的特异性配体仍在研究中，但这些受体分别被胞壁酰二肽或 ESAT-6 激活 ^7,8。C 型凝集素受体通常参与结核分枝杆菌内吞作用。虽然 Dectin-2 作为结核分枝杆菌细胞壁 ManLAM 的直接 PRR，但尚未发现 Dectin-1 配体⁸。Mincle 和 MCL 都识别糖脂海藻糖-6,6′-二菌酸盐 （TDM），也称为脐带因子⁷。DCAR 与分枝杆菌糖脂磷脂酰肌醇甘露糖苷 （PIM） 相互作用⁷。CR3 识别分枝杆菌 LAM 和 PIM，DC-SIGN 连接 ManLAM，MR 识别许多结核分枝杆菌成分，包括 ManLAM、PIM、LM、38-kDa 糖蛋白、19-kDa 抗原和其他甘露糖基化蛋白，而 DCIR 配体仍未鉴定。

可溶性 CLR 包括 SP-A，可识别 ManLam、LM、60-kDa 糖蛋白和糖蛋白 Apa;SP-D 与 LAM、LM 和 PILAM 相互作用;以及专门从事 ManLAM 识别的 MBL ^6,7。SR-A 和 MARCO 的配体是 TDM，SR-B1 识别 ESAT-6，CD36 结合 ManLAM 和 LM ^7,8。此外，Dectin-1、Mincle 和 MARCO 还可以与 TLR2 或 TLR4 结合，在检测到结核分枝杆菌 PAMP 后触发信号 ^6,7。CD14 是一种表面受体，具有内化非调理性细菌的能力，并且还能识别热休克蛋白伴侣蛋白 60.1。特别是，CD14 与 MARCO 和 TLR2⁶ 一起作为辅助受体发挥作用。AIM2 是一种胞质受体，可以在结核分枝杆菌从吞噬体中逃逸时感应 ssDNA⁸。最后，AhR 是一种配体激活的转录因子，可结合来自结核分枝杆菌 ⁶ 的色素毒力因子萘醌 phthiocol。

上述许多相互作用都是假设的，并没有严格证明。甚至某些受体的配体仍然未知，这加强了更好地了解结核分枝杆菌免疫识别领域的必要性。在这种情况下，共刺激分子 SLAMF1 （信号淋巴细胞激活分子） 最近被 Barbero 等人描述为结核分枝杆菌受体¹⁰。SLAMF1 不仅作为信号分子，还作为结核分枝杆菌传感器，在结核病中具有特别有趣的作用。SLAMF1 可以通过调节保护功能来诱导免疫细胞的激活，例如 T 细胞通过 Erk/CREB 磷酸化产生 IFN-γ^11,12,13、中性粒细胞中的自噬¹⁴ 和巨噬细胞中的细菌清除¹⁵。

多年来，人们使用 ELISA、表面等离子体共振 （SPR）、等温滴定量热法 （ITC）、荧光偏振 （FP）、X 射线晶体学、核磁共振 （NMR） 光谱、微量热泳 （MST）、共振能量转移（例如，BRET 或 FRET）共聚焦显微镜、电子显微镜、冷冻电子显微镜 （Cryo-EM） 和原子力显微镜 （AFM） 等技术研究了受体-配体相互作用^16,17， 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28。其中一些方法意味着使用报告基因、标记的重组蛋白或嵌合分子、敲除、敲低或过表达模型。或者，计算工具可以预测受体-配体相互作用和结合位点，并且通常与生物学方法结合使用，以全面了解相互作用 29,30,31。这里描述了检测生化相互作用的两种替代方案，以及有关如何荧光标记细菌的部分。提出了一种允许在体外研究受体-病原体相互作用的方案，特别是通过流式细胞术和荧光显微镜评估 SLAMF1-M. 结核病参与，这两种通常可用且常规使用的技术。

研究方案

所有涉及人单核细胞来源的巨噬细胞的程序均根据赫尔辛基宣言 （2013） 并经 UNNOBA 伦理委员会 （COENOBA） 同意进行。在样本采集前获得书面知情同意书。男性/女性组分布为 13/6，中位年龄为 32 岁，四分位距 （IQR） 为 18-75 岁。既往病症、合并症或结核病阳性诊断的存在被定义为排除标准。试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 单核细胞衍生的巨噬细胞培养和刺激

1. 抽血
   1. 通过在肝素化注射器中进行静脉穿刺，从健康捐献者那里获得 60 mL 血液。
      注意：血液提取必须由生物化学家或采血技术人员进行。
   2. 丢弃锐器处理容器中的针头和病理废物容器中与献血者血液接触过的任何材料。
2. 单核细胞分离和巨噬细胞生成
   1. 小心地将血液转移到 50 mL 试管中，并用生理盐水溶液将其稀释一半。
   2. 在密度梯度培养基上进行离心，以获得外周血单核细胞 （PBMC）。
   3. 从白色光晕中收集 PBMC。
   4. 用盐水溶液以 400 x g 的浓度洗涤 10 分钟，最后在 20 °C 下以 200 x g 洗涤 15 分钟，以消除血小板。
   5. 确定细胞计数室中 PBMC 的数量，并使用 CD14 珠子进行 CD14 阳性磁性选择。
      注意： 在磁性选择过程中，请仔细遵循制造商的说明。此外，可以使用流式细胞术检查分离的单核细胞的纯度。
   6. 将分离的细胞重悬于 RPMI 1640 中，并确定细胞计数室中单核细胞的数量。
   7. 在没有血清的情况下，将 500 μL 1 ×^{10 个 6}/mL CD14 阳性选择单核细胞接种在 24 孔细胞培养板中，以促进粘附。
   8. 2 小时后，用预热的 RPMI 1640 洗涤非贴壁细胞，去除非贴壁细胞。
   9. 为了区分巨噬细胞，在 1 mL 完全培养基（补充有 L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清 （FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI 1640 培养基）中再培养 16-18 小时（过夜）。
   10. 第二天，更换培养基。去除培养基，用 1 mL 的 1x PBS 洗涤，并加入 1 mL 的完全培养基。
   11. 用超声处理的结核分枝杆菌（结核分枝杆菌抗原（Ags））刺激巨噬细胞24小时。每 1 × 10^{6 个单}核细胞衍生的巨噬细胞使用 10 μL 结核分枝杆菌 Ags（10 μL = 1 × 10⁶ 个细菌）。
       注意：10 μL 结核分 枝杆菌 Ags （Mtb Ags） = 1 × 10⁶ 个细菌，在分光光度计中通过 OD 600_nm 定量，考虑 1 的外径为 1 x 10⁸ 个细菌/mL。所有培养步骤均使用 BSL2 生物安全柜和 37 °C 和 5% CO₂ 气氛的培养箱。
3. SLAMF1 表达的佐证
   1. 从单个孔中收集巨噬细胞。将培养板放在冷的表面上。通过连续两次加入 1 mL 冷 FACS（1x PBS + 2% FBS）来使用上下运动分离细胞。使用细胞术圆底管进行采集。
   2. 将细胞在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟。 倾倒上清液，丢弃上清液。
   3. 用荧光团偶联的抗人 SLAMF1 抗体在 4 °C 下在黑暗中对细胞染色 30 分钟。加入 1.25 μL 抗体后涡旋。
   4. 使用 FACS 洗涤细胞以消除过量的抗体，在 FACS 中重悬沉淀，并使用流式细胞仪采集样品。
      注：1.25 μL 抗 SLAMF1 抗体相当于 0.0625 μg 用于标记 0.5 x 10⁶ 个巨噬细胞。但是，强烈建议对抗体进行滴定，并进行相应的同种型或荧光减一 （FMO） 对照。

2. 总细胞蛋白提取物制备

1. 裂解缓冲液制备
   1. 用 NaCl 150 mM、Tris 10 mM、EDTA 5 mM、SDS 1%、Triton X-100 1% 和脱氧胆酸钠 1% 制备放射免疫沉淀测定 （RIPA） 缓冲液。
   2. 用 1 mM 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 和蛋白酶抑制剂（如胃蛋白酶抑制剂 A 和亮肽素）补充 RIPA 缓冲液。
2. 细胞收集和蛋白质分离
   1. 使用 P1000 移液器从板孔中丢弃完整的 RPMI，并通过用冷的 1x PBS 上下移液来收获巨噬细胞。
   2. 将细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中。每个微管收集一个孔。
   3. 在 4 °C 下以 500 x g 离心 5 分钟。 丢弃上清液。
   4. 加入 1 mL 冷 PBS 并重复步骤 2.2.2 和 2.2.3，将细胞收集在同一微量离心管中。
   5. 将细胞沉淀重悬于 100 μL 的 1x PBS 中，并合并四个试管。重复步骤 2.2.3。每管将包含 2 x 10⁶ 个巨噬细胞。
   6. 加入 100 μL 补充的 RIPA 缓冲液，将悬浮液在冰上孵育 1 小时，每 10 分钟涡旋一次。
   7. 以 14,000 x g 离心 15 分钟。收集上清液并保存至-20°C下使用。

3. 流式细胞术检测 结核分枝杆菌 -SLAMF1 相互作用

1. 蛋白质-细菌交联
   1. 将 1 × 10⁶ 个整个灭活 的结核分枝杆菌 细胞（WCMtb，γ 射线照射灭活的 结核分枝杆菌 ）与来自 1 x 10⁶ 个巨噬细胞 （50 μL） 的蛋白质提取物在 4 °C 下在旋转的微管支架中孵育过夜。
      注意：10 μL WCMtb = 1 × 10⁶ 个细菌，在分光光度计中通过外径 600_nm 定量，考虑外径 1 为 1 x 10⁸ 个细菌/mL。
   2. 第二天，加入 500 μL 在 1x PBS 中稀释的 1% 甲醛。在室温 （RT） 下搅拌（摇床）孵育 15 分钟。
   3. 加入 25 μL 用水稀释的 0.125 M 甘氨酸。在 RT 下搅拌（摇床）孵育 5 分钟。
   4. 用 1 mL 的 1x PBS 以 14,000 x g 洗涤两次，持续 5 分钟。在洗涤步骤之间丢弃上清液。
   5. 重悬沉淀，并将悬浮液在 500 μL 2 mM 乙二醇双（琥珀酰亚胺琥珀酸酯）（EGS）交联剂中稀释，在 1：1 冰醋酸：水混合物中孵育 1 小时。
      注：强烈建议在使用时制备试剂。要制备 EGS，必须将冰醋酸和水以等比例混合并加热至 70 °C。 如果溶液不热，则 EGS 不会完全重悬。
2. SLAMF1 染色
   1. 重复步骤 3.1.4，在第一次洗涤中使用 500 μL 的 1x PBS，在第二次洗涤中使用 1 mL。
   2. 通过将抗体加入微管中并涡旋，将蛋白质 - 细菌复合物在4°C下在黑暗中用抗人SLAMF1抗体（如步骤1.3.3所示）染色30分钟。使用适合 1 x 10⁶ 个细胞（2.5 μL 或 0.125 μg）的抗体量。
   3. 使用 FACS 洗涤细胞以消除过量的抗体，在 FACS 中重悬沉淀，并在流式细胞仪中获取样品（如步骤 1.3.4 所示）。
      注意：执行相应的同种型或 FMO 控制。

4. 结核分枝 杆菌抗原标记

1. 将罗丹明 B 重悬于乙醇中，储备浓度为 5 mg/mL （1000x）。在 -20 °C 下储存直至使用。
2. 在 1.5 mL 微量离心管中，每 100 μL 结核分 枝杆菌 Ags 加入 1 μL 罗丹明 B。
3. 在 RT 中连续搅拌（涡旋）孵育 45 分钟。
4. 使用 1 mL 的 1x PBS 在 24 °C 下以 14,000 x g 洗涤至少 3 次，每次 5 分钟，直到上清液透明。颗粒 （Mtb-R Ags） 看起来是浅粉色的。
5. 将 Mtb-R Ags 重悬于 100 μL 1x PBS 中以恢复初始体积。
   注意：建议在无菌条件下工作。确保在进行实验之前立即进行染色。

5. 荧光显微镜下结核分枝 杆菌 -SLAMF1 相互作用

1. 细菌-蛋白质交联
   1. 使用圆头手术镊子将 12 mm 圆形盖玻片引入 24 孔培养板（每孔 1 个盖玻片）中。
      注：用 70% 乙醇彻底清洁盖玻片。如果需要，可以在紫外光下高压灭菌或灭菌 30 分钟。
   2. 将盖玻片与 400 μL 10 μg/mL 聚-D-赖氨酸在 4 °C 下孵育过夜。 用铝箔盖住板以保护其避光。
   3. 第二天，从冰箱中取出板，用 1 mL 水清洗盖玻片两次。
   4. 让盖玻片干燥。
   5. 在 180 μL 1x PBS 中稀释 20 μL （2 x 10⁶） 的 Mtb-R Ags。最后的 200 μL 足以完全覆盖盖玻片。
   6. 将盖玻片与 Mtb-R Ags 在细胞培养箱中于 37 °C 孵育 1 小时。
   7. 弃去剩余的液体，用 1 mL 的 1x PBS 洗涤两次。
      注：在此步骤中，可以使用与红色通道相对应的滤光片的荧光显微镜检查 Mtb-R 对盖玻片的正确粘附。
   8. 在 RT 搅拌（摇床）下加入 400 μL 封闭缓冲液（1x PBS 中的 10% FBS）30 分钟。
   9. 用 400 μL 封闭缓冲液洗涤两次。
   10. 与 100 μL 蛋白质提取物在 300 μL 1x PBS 中稀释，在 RT 搅拌（摇床）下孵育 2 小时。
   11. 加入 400 μL 在 1x PBS 中稀释的 1% 甲醛。在 RT 下搅拌（摇床）孵育 15 分钟。
   12. 加入 500 μL 甘氨酸 0.125 M，用水稀释。在 RT 下搅拌（摇床）孵育 5 分钟。
   13. 用 1 mL 的 1x PBS 洗涤两次。
   14. 在 RT 搅拌（摇床）下加入 400 μL 2 mM EGS 1 小时。
   15. 重复步骤 5.1.13
       注：强烈建议在使用时制备试剂。
2. SLAMF1 染色
   1. 用石蜡膜包裹培养板的盖子。
   2. 在石蜡膜覆盖的盖子上加入一滴 60 μL 先前滴定的抗 SLAMF1 一抗（1：75 稀释）。
   3. 使用弯曲的细尖手术镊子和针头小心地从板上取下盖玻片。
      注意：为了便于取下盖玻片，针头可以弯曲大约 45° 角。
   4. 将盖玻片倒置在含有抗体的液滴上。在 RT 黑暗中孵育 30 分钟。
   5. 提起盖玻片并用封闭缓冲液洗涤两次。
   6. 将盖玻片倒置在含有二抗（1：200 稀释）的新液滴上。在 RT 黑暗中孵育 30 分钟。
   7. 重复步骤 5.2.5。
   8. 除去多余的液体，将盖玻片安装在放置在载玻片上的一滴封固液上。
   9. 使用适当的滤光片在荧光显微镜下观察。
      注意：建议在无菌条件下工作。稀释封闭缓冲液中的抗体。小心处理盖玻片，以避免可能妨碍显微镜下观察的划痕。强烈建议使用适用于荧光的封固液。

结果

在这项工作中，提供了一种方案，允许评估结核分枝杆菌与人巨噬细胞中免疫受体 SLAMF1 的相互作用（图 1）。为此，获得了来自健康供体的外周血。然后，通过在密度梯度培养基上离心分离 PBMCs，并通过磁性阳性选择分离单核细胞 （≥95% 纯度，图 2A，B）。将分离的单核细胞粘附在塑料培养板上 2 小时以获...

讨论

本研究为研究 结核分枝 杆菌与人类巨噬细胞中表达的微生物传感器之间的生化相互作用提供了有用的指南，巨噬细胞是结核病期间参与宿主反应的关键细胞类型。提供的协议将与破译在 结核分枝杆菌 进入吞噬细胞中起作用的分子相关。

表征生物分子相互作用，例如病原体和免疫受体之间的相互作用，对于理解结核分枝杆菌引发...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 secondary antibody	Invitrogen	A21121	For fluorescence microscopy
anti-SLAMF1 FITC antibody	eBioscience	11-1509-42	For flow cytometry
anti-SLAMF1 PE antibody	BioLegend	306308	For flow cytometry
anti-SLAMF1 primary antibody	BioLegend	306302	For fluorescence microscopy
Aqua-Poly/Mount	Polysciences	18606-20	Mounting media
CD14 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-097-052	For monocytes isolation
Coverslips 12mm	HDA	-	For interaction assay by microscopy
EGS	ThermoFisher Scientific	21565	For crosslinking treatment
FACSCanto II	BD Biosciences	338960	Flow cytometer with BD FACSDiva software
Fetal Bovine Serum	Natocor	-	Inactivated and irradiated, for macrophages culture
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva	17144003	For PBMCs separation
Fiji/ImageJ	Open Source software	-	For micrographs analysis
FlowJo 7.6.2	Tree Star	-	For flow cytometry analysis
Formaldehyde	Merck	K47740803613	For crosslinking treatment
Glass slides	Glass Klass	-	For interaction assay by microscopy
Glycine	Sigma	G8898	For crosslinking treatment
Imager.A2	Carl Zeiss	430005-9901-000	Fluorescence microscope with Colibri 7 illumination module
iMark	BIO-RAD	1681130	Microplate absorbance reader
L-glutamine	Sigma Aldrich	49419	For macrophages culture
M. tuberculosis, strain H37Rv, gamma-irradiated whole cells	BEI Resources, NIAID, NIH	NR-14819	For interaction assay
M. tuberculosis, strain H37Rv, whole cell lysate	BEI Resources, NIAID, NIH	NR-14822	For macrophages stimulation and interaction assay
Neofuge 13R	Heal Force	Neofuge 13R	High Speed Refrigerated Centrifuge for protein extraction
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	For macrophages culture
PMSF	ThermoFisher Scientific	36978	For proteins isolation
Poly-D-Lysine	Sigma Aldrich	A-003-M	For coverslips treatment
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P8340	For proteins isolation
Rhodamine B	Sigma Aldrich	21955	For M. tuberculosis staining
RPMI 1640	Gibco	11875093	For macrophages culture
Sorvall ST 16/16R centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004240	For PBMCs and monocytes isolation