JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışma, Mycobacterium tuberculosis'in SLAMF1 mikrobiyal sensörü ile etkileşimini değerlendirmek için bir protokol sağlar. Deneyler, akış sitometrisi ve floresan mikroskobu kullanılarak insan monositinden türetilmiş makrofajlar üzerinde gerçekleştirildi. Açıklanan araçlar, patojenler ve immünoreseptörler arasındaki etkileşimleri incelemek için önemlidir.

Özet

Patojenler ve immün reseptörler arasındaki doğrudan etkileşimin değerlendirilmesi genellikle karmaşık teknikler içerir veya transgenik suşların ve genetik olarak tasarlanmış hücrelerin kullanımını ima eder. Burada, makrofaj mikrobiyal sensörü SLAMF1 ile Mycobacterium tuberculosis arasındaki biyokimyasal etkileşimi tespit etmek için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır. Akış sitometrisi ve floresan mikroskobu kullanan iki teknik yaklaşım geliştirilmiştir. İnsan makrofajlarından toplam hücre protein ekstraktları üretildi, daha sonra M. tuberculosis (WCMtb) veya M. tuberculosis antijenlerinin (Mtb Ags) tüm hücreleri ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi ve son olarak formaldehit/glisin/etilen glikol bis (süksinimidil süksinat) tedavisi kullanılarak çapraz bağlandı. Akış sitometrisi ile WCMtb ile SLAMF1 etkileşimi, PE'ye özgü bir anti-SLAMF1 antikoru ile tespit edildi. Floresan mikroskobu ile etkileşimin varlığı, monosit türevli makrofajlardan elde edilen toplam protein ekstraktı ile inkübe edilen poli-D-lizin kaplı slaytlara Rhodamine-PE boyanmış Mtb Ags eklenerek gerçekleştirildi. Çapraz bağlama işleminden sonra SLAMF1, birincil (anti-SLAMF1) ve ikincil (Alexa Fluor 488) antikorlar kullanılarak görselleştirildi. Tahliller, patojen-immünoreseptör etkileşimlerini ölçmek için güçlü bir biyokimyasal araç sağladı ve transgenik hücre hatları ve protein gen ekspresyon modülasyon deneyleri ile ilgili zorlukların üstesinden geldi.

Giriş

142 yıl önce tanımlanan tüberküloza neden olan patojen olan Mycobacterium tuberculosis, şu anda dünya nüfusunun en az dörtte birini enfekte eden küresel bir sorun olmaya devam etmektedir1. Enfekte insanlardan havadaki damlacıklar yoluyla bulaşan M. tuberculosis, akciğerlerdeki alveoler makrofajlara ulaşır ve burada gizli bir durumda uzun süre hayatta kalabilir 2,3. Sadece lokal makrofajik yanıt aktive edilmekle kalmaz, aynı zamanda son yıllarda, periferik monositlerin solunum yollarına alınabileceği ve alveolar makrofajlara farklılaşabileceği ve M. tuberculosis'e karşı fetal kökenli muadillerine göre daha güçlü bir yanıt oluşturduğu tanımlanmıştır 2,4.

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklığın temel oyuncularıdır. M. tuberculosis yutulduktan sonra, makrofajlar, M. tuberculosis'i öldürmek için proinflamatuar sitokinlerin salgılanması, fagolizozomun füzyonu ve diğer bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu gibi çok sayıda mikrobisidal fonksiyon gösterir 2,3. Bununla birlikte, bu patojenin karmaşık mimari yapısı, makrofaj metabolizmasını ve fonksiyonlarını ve sonuç olarak enflamatuar sürecidüzenleyebilen efektörler (örneğin proteinler ve lipitler) sağlar 3. Virülans faktörlerinin salgılanması veya konak faktörlerinin sömürülmesi yoluyla makrofaj yanıtlarının bu şekilde manipüle edilmesi, M. tuberculosis tarafından uygulanan farklı kaçış stratejilerine yol açar.Bazı önemli kaçınma mekanizmaları arasında anti-inflamatuar sitokinlerin indüksiyonu, fagolizozom olgunlaşmasının ve asitleşmesinin inhibisyonu, oksidatif stres değişiklikleri, otofaji bozulması ve antijen işleme ve sunumu sırasındaki eksiklikler yer alır 3,5.

Makrofajlar ve M. tuberculosis arasında sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir etkileşim, uygun bir immün yanıtın gelişimi için çok önemlidir. Bu nedenle, bu sinapsları incelemek, konak-patojen karışmasının neden olduğu immünoprotektif veya immünopatojenik mekanizmaların tanımlanmasının yanı sıra potansiyel terapötik hedeflerin tanımlanmasının anahtarıdır. TLR'ler 6,7,8, NLR'ler 7,8, kompleman reseptörleri 6,8, C-tipi lektin reseptörleri 6,8 ve çöpçü reseptörleri 6,8 dahil olmak üzere birçok reseptör M. tuberculosis'in tanınmasına ve/veya içselleştirilmesine aracılık eder. Biriken veriler, hem yüzeye bağlı hem de hücre içi PRR'lerin enfeksiyon sırasında önemli bir rol oynadığını, opsonize ve opsonize olmayan M. tuberculosis'i tanıdığını göstermektedir.

Zihad ve Sifat ve ark. yakın zamanda PRR'lerin doğuştan gelen hücreler tarafından M. tuberculosis'in neden olduğu yanıtlara katılımını gözden geçirmişlerdir9. Özellikle, TLR ailesinin çoğu üyesi, M. tuberculosis ligandları 6,7 ile etkileşimde rol oynamıştır. Yüzey TLR2, asillenmiş lipoproteinler, 19-kDa lipoprotein, LprA lipoprotein, LprG lipoprotein, 30-kDa antijen, 38-kDa antijen, MymA, prolin-prolin-glutamik asit (PPE)-57, LAM, LM, PIM, ısı şoku proteini 60, imza proteini Rv1509 ve salgılanan protein ESAT-67 gibi mikobakteriyel antijenleri tanır. Membran TLR4, ısı şoku proteinleri, 38-kDa antijeni, RpfE, Rv0652, Rv0335c, Rv2659c, Rv1738, Rv2627c, Rv2628, GrpE ve HBHA ile etkileşime girer. Öte yandan, endozomal TLR'ler için ligandlar (TLR 3, 7, 8 ve 9) dsRNA, tRNA, ssRNA, fagozomal RNA ve M. tuberculosis'in dsDNA'sını içerir. Ek olarak, TLR2, TLR1 ve TLR6, TLR4 ve TLR9 6,7 ile birlikte hareket ettiğinde bağışıklık tepkilerini başlatmada aktif bir role sahiptir. NOD2 ve NLRP3, Tüberkülozda en iyi karakterize edilen sitoplazmik NLO'lardır. Spesifik ligandları incelenmeye devam etse de, bu reseptörler sırasıyla muramil dipeptit veya ESAT-6 tarafından aktive edilir 7,8. C-tipi lektin reseptörleri klasik olarak M. tuberculosis endositozunda rol oynar. Dectin-2, M. tuberculosis hücre duvarının ManLAM'ı için doğrudan bir PRR görevi görürken, Dectin-1 ligandı henüz keşfedilmemiştir8. Mincle ve MCL'nin her ikisi de kordon faktörü7 olarak da adlandırılan glikolipid trehaloz-6,6'-dimikolatı (TDM) tanır. DCAR, mikobakteriyel glikolipidler fosfatidil-miyo-inositol mannositler (PIM'ler) ile etkileşime girer7. CR3, mikobakteriyel LAM ve PIM'i tanır, DC-SIGN ManLAM'ı bağlar, MR, ManLAM, PIM, LM, 38-kDa glikoprotein, 19-kDa antijen ve diğer mannosile proteinler dahil olmak üzere bir dizi M. tuberculosis bileşenini tanır.

Çözünür CLR'ler arasında ManLam, LM, 60-kDa glikoprotein ve glikoprotein Apa'yı tanıyan SP-A; SP-D, LAM, LM ve PILAM ile etkileşim; ve ManLAM tanımakonusunda uzmanlaşmış MBL 6,7. SR-A ve MARCO, ligandları olarak TDM'ye sahiptir, SR-B1, ESAT-6'yı tanır ve CD36, ManLAM ve LM 7,8'i bağlar. Ek olarak, Dectin-1, Min ve MARCO, M. tuberculosis PAMPs 6,7'yi tespit ettikten sonra sinyalleri tetiklemek için TLR2 veya TLR4 ile de birleşebilir. CD14, opsonize olmayan bakterileri içselleştirme yeteneğine sahip bir yüzey reseptörüdür ve ayrıca ısı şoku proteini Chaperonin 60.1'i tanır. Özellikle, CD14, MARCO ve TLR26 ile birlikte bir ko-reseptör olarak işlev görür. AIM2, M. tuberculosis'in fagozom8'den kaçması üzerine ssDNA'yı algılayabilen sitozolik bir reseptördür. Son olarak, AhR, M. tuberculosis6'dan pigmentli virülans faktörü naftokinon phtiocol'ü bağlayan ligandla aktive olan bir transkripsiyon faktörüdür.

Yukarıda açıklanan etkileşimlerin çoğu varsayılmıştır ve kesin olarak gösterilmemiştir. Bazı reseptörler için ligandlar bile bilinmemektedir, bu da M. tuberculosis immün tanıma alanını daha iyi anlama ihtiyacını güçlendirmektedir. Bu bağlamda, stimülatör molekül SLAMF1 (Signaling Lymphocytic Activation Molecule) yakın zamanda Barbero ve ark.10 tarafından bir M. tuberculosis reseptörü olarak tanımlanmıştır. Sadece bir sinyal molekülü olarak değil, aynı zamanda bir M. tuberculosis sensörü olarak da hareket eden SLAMF1, Tüberkülozda özellikle ilgi çekici bir role sahiptir. SLAMF1, Erk/CREB fosforilasyonu 11,12,13, nötrofillerdeotofaji 14 ve makrofajlarda bakteriyel klirens15 yoluyla T hücreleri tarafından IFN-γ üretimi gibi koruyucu fonksiyonları modüle ederek bağışıklık hücrelerinin aktivasyonunu indükleyebilir.

Reseptörler-ligand etkileşimleri, ELISA, Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR), İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi (ITC), Floresan Polarizasyonu (FP), X-ışını Kristalografisi, Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) Spektroskopisi, Mikro Ölçekli Termoforez (MST), Rezonans Enerji Transferi (örneğin, BRET veya FRET) Konfokal Mikroskopi, Elektron Mikroskobu, Kriyo-Elektron Mikroskobu (Cryo-EM) ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) gibi teknikler kullanılarak yıllar boyunca incelenmiştir16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Bu yaklaşımlardan bazıları, raportör genlerin, etiketli rekombinant proteinlerin veya kimerik moleküllerin, nakavt, nakavt veya aşırı ekspresyon modellerinin kullanımını ima eder. Alternatif olarak, hesaplama araçları reseptör-ligand etkileşimlerini ve bağlanma bölgelerini tahmin edebilir ve etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlamak için genellikle biyolojik yaklaşımlarla birlikte kullanılır 29,30,31. Burada, biyokimyasal etkileşimi tespit etmek için iki alternatif ve ayrıca bakterilerin floresan olarak nasıl etiketleneceğine dair bir bölüm açıklanmaktadır. Reseptör-patojen etkileşimlerinin in vitro olarak incelenmesine izin veren bir protokol sunulmakta, özellikle SLAMF1-M. genellikle mevcut ve rutin olarak kullanılan iki teknik olan akış sitometrisi ve floresan mikroskobu yoluyla tüberküloz etkileşimi.

Protokol

İnsan monosit kaynaklı makrofajları içeren tüm prosedürler Helsinki Bildirgesi'ne (2013) uygun olarak ve UNNOBA (COENOBA) Etik Kurulu ile mutabık kalınarak gerçekleştirilmiştir. Numune alınmadan önce yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Erkek/kadın grup dağılımı 13/6 ve ortanca yaş 32 olup, çeyrekler arası aralık (IQR) 18-75 yıl idi. Geçirilmiş patolojiler, komorbiditeler veya Tüberküloz için pozitif tanı varlığı dışlama kriteri olarak tanımlandı. Reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Monosit kaynaklı makrofaj kültürü ve stimülasyonu

  1. Kan alımı
    1. Heparinize bir şırıngada damar delinmesi yoluyla sağlıklı donörlerden 60 mL kan elde edin.
      NOT: Kan ekstraksiyonu bir biyokimyacı veya flebotomi teknisyeni tarafından yapılmalıdır.
    2. İğneyi kesici alet imha kabına ve bağışçıların kanıyla temas etmiş herhangi bir materyali patolojik atık kabına atın.
  2. Monosit izolasyonu ve makrofaj üretimi
    1. Kanı dikkatlice 50 mL'lik tüplere aktarın ve tuzlu su çözeltisi ile yarı yarıya seyreltin.
    2. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) elde etmek için yoğunluk gradyanlı bir ortam üzerinde santrifüjleme gerçekleştirin.
    3. PBMC'leri beyazımsı haleden toplayın.
    4. Trombositleri ortadan kaldırmak için 10 dakika boyunca 400 x g'da tuzlu su çözeltisi ile iki yıkama ve 20 ° C'de 15 dakika boyunca 200 x g'da son bir yıkama yapın.
    5. Bir hücre sayma odasındaki PBMC'lerin sayısını belirleyin ve CD14 boncukları ile CD14 pozitif manyetik seçimi gerçekleştirin.
      NOT: Manyetik seçim sırasında, üreticinin talimatlarını dikkatlice izleyin. Ek olarak, akış sitometrisi kullanılarak izole edilmiş monositlerin saflığı kontrol edilebilir.
    6. RPMI 1640'ta izole edilmiş hücreleri yeniden süspanse edin ve bir hücre sayma odasındaki monosit sayısını belirleyin.
    7. Yapışmayı arttırmak için serum yokluğunda 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasında oyuk başına 500 μL 1 × 106 / mL CD14 pozitif seçilmiş monositleri tohumlayın.
    8. 2 saat sonra, yapışmayan hücreleri önceden ısıtılmış RPMI 1640 ile yıkayarak çıkarın.
    9. Makrofajları ayırt etmek için, yapışık monositleri 1 mL tam ortamda (L-glutamin,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamı 16-18 saat (gece boyunca) kültürleyin.
    10. Ertesi gün, kültür ortamını değiştirin. Ortamı çıkarın, 1 mL 1x PBS ile yıkayın ve 1 mL tam ortam ekleyin.
    11. Makrofajları 24 saat boyunca sonikasyonlu M. tuberculosis (M. tuberculosis antijenleri (Ags)) ile uyarın. 1 × 10 6 monosit türevi makrofaj başına 10 μL M. tuberculosis Ags (10 μL = 1 ×10 6 bakteri) kullanın.
      NOT: 10 μL M. tuberculosis Ags (Mtb Ags) = 1 × 106 bakteri, 1 x 108 bakteri/mL olarak 1 OD dikkate alınarak spektrofotometrede OD 600nm ile ölçülür. Tüm kültüradımları için %5 CO 2 içeren bir atmosferde BSL2 biyogüvenlik kabinleri ve 37 °C'de bir inkübatör kullanın.
  3. SLAMF1 ifadesinin doğrulanması
    1. Makrofajları tek bir kuyudan toplayın. Kültür plakasını soğuk bir yüzeye yerleştirin. Arka arkaya iki kez 1 mL soğuk FACS (1x PBS +% 2 FBS) ekleyerek yukarı ve aşağı hareketler kullanarak hücreleri ayırın. Toplama için bir sitometri yuvarlak tabanlı tüp kullanın.
    2. Hücreleri 500 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atarak atın.
    3. Hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika boyunca floroforla birleştirilmiş bir anti-insan SLAMF1 antikoru ile boyayın. 1.25 μL antikor ekledikten sonra girdap.
    4. FACS kullanarak antikor fazlalığını ortadan kaldırmak için hücreleri yıkayın, peleti FACS'ta yeniden süspanse edin ve numuneyi bir akış sitometresi kullanarak elde edin.
      NOT: 1.25 μL anti-SLAMF1 antikoru, 0.5 x 106 makrofajları etiketlemek için kullanılan 0.0625 μg'ye karşılık gelir. Bununla birlikte, antikorun titrasyonunun yanı sıra karşılık gelen izotip veya Floresan Eksi Bir (FMO) kontrolünün gerçekleştirilmesi şiddetle tavsiye edilir.

2. Toplam hücre protein özütü hazırlama

  1. Lizis tamponu hazırlama
    1. NaCl 150 mM, Tris 10 mM, EDTA 5 mM, SDS %1, Triton X-100 %1 ve Sodyum Deoksikolat %1 ile Radyo İmmünopresipitasyon Testi (RIPA) tamponu hazırlayın.
    2. RIPA tamponunu 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve Pepstatin A ve Leupeptin gibi proteaz inhibitörleri ile destekleyin.
  2. Hücre toplama ve protein izolasyonu
    1. Bir P1000 pipeti kullanarak plaka kuyularından tam RPMI'yi atın ve soğuk 1x PBS ile yukarı ve aşağı pipetleme yaparak makrofajları hasat edin.
    2. Hücreleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Mikrotüp başına bir kuyu toplayın.
    3. 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
    4. 1 mL soğuk PBS ekleyin ve hücreleri aynı mikrosantrifüj tüpünde toplayarak 2.2.2 ve 2.2.3 adımlarını tekrarlayın.
    5. Hücre peletlerini 100 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve dört tüpü bir araya getirin. Adım 2.2.3'ü tekrarlayın. Her tüp 2 x 106 makrofaj içerecektir.
    6. 100 μL takviye edilmiş RIPA tamponu ekleyin ve süspansiyonu her 10 dakikada bir girdap yaparak 1 saat buz üzerinde inkübe edin.
    7. 15 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve -20 °C'de kullanılana kadar muhafaza edin.

3. Akış sitometrisi ile M. tuberculosis-SLAMF1 etkileşimi

  1. Proteinler-bakterilerin çapraz bağlanması
    1. 1 × 106 tam inaktive edilmiş M. tuberculosis hücrelerini (WCMtb, M. tuberculosis gama ışınlaması ile inaktive edilmiş) 1 x 106 makrofajdan (50 μL) protein özütü ile gece boyunca 4 ° C'de dönen bir mikrotüp tutucuda inkübe edin.
      NOT: 10 μL WCMtb = 1 × 106 bakteri, 1 x 108 bakteri/mL olarak 1 OD dikkate alınarak spektrofotometrede OD 600nm ile ölçülür.
    2. Ertesi gün, 1x PBS'de seyreltilmiş 500 μL %1 formaldehit ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) çalkalama (çalkalayıcı) altında 15 dakika inkübe edin.
    3. Suda seyreltilmiş 25 μL 0.125 M glisin ekleyin. RT'de çalkalama (çalkalayıcı) altında 5 dakika inkübe edin.
    4. 1 mL 1x PBS ile 14.000 x g'da 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Süpernatanı yıkama adımları arasında atın.
    5. Peleti yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 500 μL 2 mM etilen glikol bis (süksinimidil süksinat) (EGS) çapraz bağlayıcı içinde 1: 1 buzlu asetik asit karışımı içinde seyreltilmiş inkübe edin: RT'de 1 saat su.
      NOT: Reaktiflerin kullanım sırasında hazırlanması şiddetle tavsiye edilir. EGS'yi hazırlamak için buzlu asetik asit ve su eşit oranlarda karıştırılmalı ve 70 °C'ye ısıtılmalıdır. Çözelti sıcak değilse, EGS tamamen yeniden askıya alınmaz.
  2. SLAMF1 boyama
    1. İlk yıkamada 500 μL 1x PBS ve ikinci yıkamada 1 mL kullanarak adım 3.1.4'ü tekrarlayın.
    2. Protein-bakteri kompleksini karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika boyunca bir anti-insan SLAMF1 antikoru ile (adım 1.3.3'te olduğu gibi) antikoru mikrotüpe ekleyerek ve girdaplayarak boyayın. 1 x 106 hücre (2.5 μL veya 0.125 μg) için uygun antikor miktarını kullanın.
    3. FACS'ı kullanarak antikor fazlalığını ortadan kaldırmak için hücreleri yıkayın, peleti FACS'ta yeniden süspanse edin ve numuneyi bir akış sitometresinde alın (adım 1.3.4'te olduğu gibi).
      NOT: İlgili izotip veya FMO kontrolünü gerçekleştirin.

4. M. tuberculosis antijenleri etiketleme

  1. Rhodamine B'yi etanol içinde 5 mg / mL (1000x) stok konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
  2. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 100 μL M. tuberculosis Ags başına 1 μL Rhodamine B ekleyin.
  3. Sürekli çalkalama (girdap) altında RT'de 45 dakika inkübe edin.
  4. Süpernatan şeffaf olana kadar 1 mL 1x PBS kullanarak 24 ° C'de 5 dakika boyunca 14.000 x g'da en az 3 kez yıkayın. Pelet (Mtb-R Ags) açık pembe görünecektir.
  5. İlk hacmi eski haline getirmek için Mtb-R Ags'yi 100 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın.
    NOT: Steril koşullarda çalışılması tavsiye edilir. Deney yapmadan hemen önce boyamanın yapıldığından emin olun.

5. Floresan mikroskobu ile M. tuberculosis-SLAMF1 etkileşimi

  1. Bakteri-protein çapraz bağlanması
    1. Yuvarlak burunlu cerrahi cımbız kullanarak 12 mm'lik yuvarlak lamelleri 24 oyuklu kültür plakalarına (oyuk başına 1 lamel) yerleştirin.
      NOT: Lamelleri %70 etanol ile iyice temizleyin. İstenirse 30 dakika boyunca UV ışığı altında otoklavlanabilir veya sterilize edilebilirler.
    2. Lameli 400 μL 10 μg/mL Poli-D-Lizin ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Işıktan korumak için plakayı alüminyum folyo ile örtün.
    3. Ertesi gün, plakayı buzdolabından çıkarın ve lameli iki kez 1 mL su ile yıkayın.
    4. Lamelin kurumasını bekleyin.
    5. 20 μL (2 x 106) Mtb-R Ags'yi 180 μL 1x PBS içinde seyreltin. Son 200 μL, bir lamel tamamen kaplamak için yeterlidir.
    6. Lameli Mtb-R Ags ile bir hücre inkübatörde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
    7. Kalan sıvıyı atın ve 1 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın.
      NOT: Bu adımda, Mtb-R'nin lamele doğru yapışması, kırmızı kanala karşılık gelen filtreler kullanılarak bir floresan mikroskobu ile kontrol edilebilir.
    8. Çalkalayıcıda RT'de 30 dakika boyunca 400 μL engelleme tamponu (1x PBS'de% 10 FBS) ekleyin.
    9. 400 μL blokaj tamponu ile iki kez yıkayın.
    10. 300 μL 1x PBS içinde seyreltilmiş 100 μL protein özütü ile RT'de çalkalamada (çalkalayıcı) 2 saat inkübe edin.
    11. 1x PBS'de seyreltilmiş 400 μL %1 formaldehit ekleyin. RT'de çalkalama (çalkalayıcı) altında 15 dakika inkübe edin.
    12. Su ile seyreltilmiş 500 μL glisin 0.125 M ekleyin. RT'de çalkalama (çalkalayıcı) altında 5 dakika inkübe edin.
    13. 1 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın.
    14. Çalkalayıcıda RT'de 1 saat boyunca 400 μL 2 mM EGS ekleyin.
    15. Adım 5.1.13'ü tekrarlayın
      NOT: Reaktiflerin kullanım sırasında hazırlanması şiddetle tavsiye edilir.
  2. SLAMF1 boyama
    1. Kültür plakasının kapağını parafin filme sarın.
    2. Parafin film kaplı kapağa 60 μL önceden titre edilmiş anti-SLAMF1 birincil antikoru (1:75 seyreltme) damlatın.
    3. Kavisli ince uçlu cerrahi cımbız ve iğneler kullanarak lameli plakadan dikkatlice çıkarın.
      NOT: Lamellerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için iğne yaklaşık 45° açıyla bükülebilir.
    4. Antikoru içeren damlanın üzerine lamel ters çevirin. Karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    5. Lameli kaldırın ve engelleme tamponu ile iki kez yıkayın.
    6. Lameli ikincil antikoru (1:200 seyreltme) içeren yeni bir damla üzerine ters çevirin. Karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    7. Adım 5.2.5'i tekrarlayın.
    8. Fazla sıvıyı çıkarın ve lamel bir cam slayt üzerine yerleştirilmiş bir damla montaj sıvısının üzerine monte edin.
    9. Yeterli filtreler kullanarak floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
      NOT: Steril koşullarda çalışılması tavsiye edilir. Bloke edici tampondaki antikorları seyreltin. Mikroskop altında gözlemi engelleyebilecek çizikleri önlemek için lameli dikkatli bir şekilde tutun. Floresan için uygun bir montaj sıvısı şiddetle tavsiye edilir.

Sonuçlar

Bu çalışmada, insan makrofajlarında M. tuberculosis'in immün reseptör SLAMF1 ile etkileşiminin değerlendirilmesine izin veren bir protokol sağlanmıştır (Şekil 1). Bu amaçla sağlıklı vericilerden periferik kan elde edildi. Daha sonra, PBMC'ler yoğunluk gradyanlı ortam üzerinde santrifüjleme ile ayrıldı ve monositler manyetik pozitif seçim ile izole edildi (%≥95 saflıkta, Şekil 2A,B

Tartışmalar

Bu çalışma, M. tuberculosis ile Tüberküloz sırasında konak yanıtında yer alan anahtar bir hücre tipi olan insan makrofajlarında eksprese edilen mikrobiyal sensörler arasındaki biyokimyasal etkileşimi incelemek için yararlı bir kılavuz sunmaktadır. Sağlanan protokoller, M. tuberculosis'in fagositlere girişinde rol oynayan moleküllerin deşifre edilmesiyle ilgili olacaktır.

Patojenler ve immünoreseptörler arasındaki gib...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (hibe numaraları SIB 0618/2019, SIB 2582/2012 V.P.), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, hibe numaraları PICT-2012-2459 ve PICT A 2017-1896'dan VP'ye ve PICT-2021-I-INVI-00584'ten A.B.'ye); Florencio Fiorini Vakfı; ve Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, hibe numarası PIO 15720150100010CO'dan VP'ye). Teknik destek için Natalia Menite ve Gastón Villafañe'ye teşekkür ederiz. Dr. Paula Barrionuevo ve Dr. Luciana Balboa'ya, bu çalışmada sunulan tahlillerin geliştirilmesine yol açan yayın sırasındaki bilimsel tartışma için teşekkür ederiz. Son olarak, çapraz bağlama protokolleri konusundaki tavsiyesi için Dr. Estermann'a teşekkür ederiz, Lic. Moroni, Poly-Lysine ve Lic ile çalışma konusundaki tavsiyeleri için. Moriconi, şematik figürler konusundaki yardımı için.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA21121For fluorescence microscopy
anti-SLAMF1 FITC antibody eBioscience11-1509-42For flow cytometry
anti-SLAMF1 PE antibody BioLegend306308For flow cytometry
anti-SLAMF1 primary antibody BioLegend306302For fluorescence microscopy
Aqua-Poly/MountPolysciences18606-20Mounting media
CD14 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-097-052For monocytes isolation
Coverslips 12mmHDA-For interaction assay by microscopy
EGSThermoFisher Scientific 21565For crosslinking treatment
FACSCanto IIBD Biosciences338960Flow cytometer with BD FACSDiva software
Fetal Bovine Serum Natocor-Inactivated and irradiated, for macrophages culture
Ficoll-Paque PLUSCytiva17144003For PBMCs separation
Fiji/ImageJOpen Source software-For micrographs analysis
FlowJo 7.6.2 Tree Star-For flow cytometry analysis
FormaldehydeMerckK47740803613For crosslinking treatment
Glass slidesGlass Klass-For interaction assay by microscopy
GlycineSigmaG8898For crosslinking treatment
Imager.A2Carl Zeiss430005-9901-000Fluorescence microscope with Colibri 7 illumination module
iMarkBIO-RAD1681130Microplate absorbance reader 
L-glutamineSigma Aldrich49419For macrophages culture
M. tuberculosis, strain H37Rv, gamma-irradiated whole cells BEI Resources, NIAID, NIHNR-14819For interaction assay
M. tuberculosis, strain H37Rv, whole cell lysateBEI Resources, NIAID, NIHNR-14822For macrophages stimulation and interaction assay
Neofuge 13RHeal ForceNeofuge 13RHigh Speed Refrigerated Centrifuge for protein extraction
Penicillin/StreptomycinGibco15140122For macrophages culture
PMSFThermoFisher Scientific36978For proteins isolation
Poly-D-LysineSigma AldrichA-003-MFor coverslips treatment
Protease Inhibitor CocktailSigma Aldrich P8340For proteins isolation
Rhodamine B Sigma Aldrich 21955For M. tuberculosis staining
RPMI 1640Gibco11875093For macrophages culture
Sorvall ST 16/16R centrifugeThermoFisher Scientific75004240For PBMCs and monocytes isolation

Referanslar

  1. . Global Tuberculosis Report 2023 Available from: https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2023)
  2. Ahmad, F., et al. Macrophage: A cell with many faces and functions in tuberculosis. Front Immunol. 13, 882130 (2022).
  3. Bo, H., et al. Mycobacterium tuberculosis-macrophage interaction: Molecular updates. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1187205 (2023).
  4. Papp, A. C., et al. AmpliSeq transcriptome analysis of human alveolar and monocyte-derived macrophages over time in response to Mycobacterium tuberculosis infection. PLoS One. 13 (5), e0198069 (2018).
  5. Zhai, W., Wu, F., Zhang, Y., Fu, Y., Liu, Z. The immune escape mechanisms of Mycobacterium tuberculosis. Int J Mol Sci. 20 (2), 340 (2019).
  6. Van Crevel, R., Ottenhoff, T. H. M., Van der Meer, J. W. M. Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 294-309 (2002).
  7. Mortaz, E., et al. Interaction of pattern recognition receptors with Mycobacterium tuberculosis. J Clin Immunol. 35 (1), 1-10 (2015).
  8. Stamm, C. E., Collins, A. C., Shiloh, M. U. Sensing of Mycobacterium tuberculosis and consequences to both host and bacillus. Immunol Rev. 264 (1), 204-219 (2015).
  9. Zihad, S. M. N. K., et al. Role of pattern recognition receptors in sensing Mycobacterium tuberculosis. Heliyon. 9 (10), e20636 (2023).
  10. Barbero, A. M., et al. SLAMF1 signaling induces Mycobacterium tuberculosis uptake leading to endolysosomal maturation in human macrophages. J Leukoc Biol. 109 (8), 257-273 (2021).
  11. Pasquinelli, V., et al. Expression of signaling lymphocytic activation molecule-associated protein interrupts IFN-γ production in human tuberculosis. J Immunol. 172 (2), 1177-1185 (2004).
  12. Pasquinelli, V., et al. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinases contributes to interferon-γ production in response to Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (2), 340-350 (2012).
  13. Pasquinelli, V., et al. IFN-γ production during active tuberculosis is regulated by mechanisms that involve IL-17, SLAM, and CREB. J Infect Dis. 199 (5), 661-665 (2009).
  14. Pellegrini, J. M., et al. Neutrophil autophagy during human active tuberculosis is modulated by SLAMF1. Autophagy. 17 (2), 423-426 (2021).
  15. Song, T., Dong, C., Xiong, S. Signaling lymphocyte-activation molecule SLAMF1 augments mycobacteria BCG-induced inflammatory response and facilitates bacterial clearance. Int J Med Microbiol. 305 (6), 572-580 (2015).
  16. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor-ligand interaction. J Vis Exp. (132), e57032 (2018).
  17. Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterization of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 43-55 (2014).
  18. Draczkowski, P., Matosiuk, D., Jozwiak, K. Isothermal titration calorimetry in membrane protein research. J Pharm Biomed Anal. 87, 296-304 (2014).
  19. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  20. García-Nafría, J., Tate, C. G. Cryo-electron microscopy: Moving beyond X-ray crystal structures for drug receptors and drug development. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 60, 51-71 (2020).
  21. Asami, J., Shimizu, T. Structural and functional understanding of the toll-like receptors. Protein Sci. 30 (4), 761-772 (2021).
  22. Phạm, T. T. T., Rainey, J. K. On-cell nuclear magnetic resonance spectroscopy to probe cell surface interactions. Biochem Cell Biol. 99 (6), 683-692 (2021).
  23. El Deeb, S., et al. Microscale thermophoresis as a powerful growing analytical technique for the investigation of biomolecular interaction and the determination of binding parameters. Methods Appl Fluoresc. 10 (4), 045001 (2022).
  24. El Khamlichi, C., et al. Bioluminescence resonance energy transfer as a method to study protein-protein interactions: Application to G protein-coupled receptor biology. Molecules. 24 (3), 505 (2019).
  25. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods Enzymol. 545, 103-125 (2014).
  26. Park, A. M. W., Schirmer, P. S. H. Atomic force microscopy: A multifaceted tool to study membrane proteins and their interactions with ligands. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 74-89 (2014).
  27. Zalejski, J., Sun, J., Sharma, A. Unravelling the mystery inside cells by using single-molecule fluorescence imaging. J Imaging. 9 (9), 183 (2023).
  28. Zheng, S., Zou, M., Shao, Y., Wu, H., Wang, X. Two-dimensional measurements of receptor-ligand interactions. Front Mol Biosci. 10, 1075587 (2023).
  29. Zlotnikov, I. D., Kudryashova, E. V. Computer simulation of the receptor-ligand interactions of mannose receptor CD206 in comparison with the lectin concanavalin A model. Biochemistry (Moscow). 87 (1), 54-69 (2022).
  30. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: A case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 2018, 7604567 (2018).
  31. Farina, B., et al. A novel approach for studying receptor-ligand interactions on living cells' surface by using NUS/T1ρ-NMR methodologies combined with computational techniques: The RGDechi15D-αvβ5 integrin complex. Comput Struct Biotechnol J. 19, 3303-3318 (2021).
  32. Driessen, N. N., et al. Role of phosphatidylinositol mannosides in the interaction between mycobacteria and DC-SIGN. Infect Immun. 77 (10), 4538-4547 (2009).
  33. Bansal, K., et al. Src homology 3-interacting domain of Rv1917c of Mycobacterium tuberculosis induces selective maturation of human dendritic cells by regulating PI3K-MAPK-NF-κB signaling and drives Th2 immune responses. J Biol Chem. 285 (47), 36511-36522 (2010).
  34. Xu, Y., et al. PPE57 induces activation of macrophages and drives Th1-type immune responses through TLR2. J Mol Med. 93 (6), 645-662 (2015).
  35. Olesen, R., et al. DC-SIGN (CD209), pentraxin 3 and vitamin D receptor gene variants associate with pulmonary tuberculosis risk in West Africans. Genes Immun. 8, 456-467 (2007).
  36. Berger, S. B., et al. SLAM is a microbial sensor that regulates bacterial phagosome functions in macrophages. Nat Immunol. 11 (10), 920-927 (2010).
  37. Degos, C., et al. Omp25-dependent engagement of SLAMF1 by Brucella abortus in dendritic cells limits acute inflammation and favours bacterial persistence in vivo. Cell Microbiol. 22 (4), e13156 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Floresan DeneyleriMycobacterium tuberculosismm n Resept rSLAMF1Biyokimyasal Etkile imAk SitometrisiFloresan MikroskobuMakrofaj Mikrobiyal Sens rToplam H cre Protein EkstraktlarAntijen Etkile imiapraz Ba lama TedavisiRodamin PEPoli D lizinMonosit t revi Makrofajlarmm noresept r Etkile imleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır