JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מספק פרוטוקול להערכת האינטראקציה של Mycobacterium tuberculosis עם החיישן המיקרוביאלי SLAMF1. הבדיקות נערכו על מקרופאגים אנושיים שמקורם במונוציטים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הכלים המתוארים רלוונטיים לחקר אינטראקציות בין פתוגנים לקולטני חיסון.

Abstract

הערכת האינטראקציה הישירה בין פתוגנים לקולטנים חיסוניים כרוכה בדרך כלל בטכניקות מתוחכמות או מרמזת על שימוש בזנים טרנסגניים ותאים מהונדסים גנטית. כאן, מתוארת שיטה חלופית לאיתור אינטראקציה ביוכימית בין חיישן המיקרוביאלי של המקרופאגים SLAMF1 ו-Mycobacterium tuberculosis . פותחו שתי גישות טכניות המשתמשות בזרימה ציטומטרית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. סך כל תמציות חלבון התאים ממקרופאגים אנושיים נוצרו, ולאחר מכן הודגרו עם תאים שלמים של אנטיגנים של M. tuberculosis (WCMtb) או M. tuberculosis (Mtb Ags) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס ולבסוף צולבו באמצעות טיפול בפורמלדהיד/גליצין/אתילן גליקול ביס (succinimidyl succinate). אינטראקציה של SLAMF1 עם WCMtb על ידי זרימה ציטומטרית זוהתה עם נוגדן אנטי-SLAMF1 ספציפי ל-PE. קיומה של אינטראקציה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בוצע על ידי הצמדת Mtb Ags מוכתמים ברודמין-PE לשקופיות מצופות פולי-D-ליזין, שהודגרו עם תמצית החלבון הכוללת ממקרופאגים שמקורם במונוציטים. לאחר טיפול צולב, SLAMF1 הודגם באמצעות נוגדנים ראשוניים (anti-SLAMF1) ומשניים (Alexa Fluor 488). הבדיקות סיפקו כלי ביוכימי חזק למדידת אינטראקציות פתוגנים-קולטנים חיסוניים, והתגברו על הקשיים הקשורים לקווי תאים טרנסגניים וניסויי אפנון ביטוי גנים של חלבונים.

Introduction

Mycobacterium tuberculosis, הפתוגן הגורם לשחפת שזוהה לפני 142 שנים, נותר אתגר עולמי, וכיום מדביק לפחות רבע מאוכלוסיית העולם1. מועבר באמצעות טיפות הנישאות באוויר מאנשים נגועים, M. tuberculosis מגיע למקרופאגים המכתשית בריאות שם הוא יכול לשרוד לתקופות ארוכות במצב סמוי 2,3. לא רק שהתגובה המקרופאגית המקומית מופעלת, אלא שבשנים האחרונות תוארה כי ניתן לגייס מונוציטים היקפיים לדרכי הנשימה ולהתמיין למקרופאגים מכתשית, מה שיוצר תגובה חזקה עוד יותר נגד M. tuberculosis מאשר מקבילם ממקור עוברי 2,4.

מקרופאגים הם שחקנים בסיסיים של מערכת החיסון המולדת. עם בליעת M. tuberculosis, מקרופאגים מציגים פונקציות חיידקיות רבות, כגון הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים, איחוי של הפגוליזוזום והפעלת תאים חיסוניים אחרים על מנת להרוג M. tuberculosis 2,3. עם זאת, המבנה הארכיטקטוני המורכב של פתוגן זה מספק אפקטורים (למשל, חלבונים ושומנים) המסוגלים לווסת את חילוף החומרים והתפקודים של המקרופאגים, וכתוצאה מכך, את התהליך הדלקתי3. מניפולציה זו של תגובות מקרופאגים, באמצעות הפרשת גורמי אלימות או ניצול גורמים מארחים, מובילה לאסטרטגיות בריחה שונות המופעלות על ידי M. tuberculosis. כמה מנגנוני התחמקות מרכזיים כוללים אינדוקציה של ציטוקינים אנטי דלקתיים, עיכוב התבגרות והחמצה של פגוליזוזום, שינויים בעקה חמצונית, הפרעה באוטופגיה וליקויים במהלך עיבוד אנטיגןוהצגתו 3,5.

אינטראקציה מווסתת היטב בין מקרופאגים ל-M. tuberculosis היא חיונית להתפתחות תגובה חיסונית תקינה. לכן, חקר סינפסות אלו הוא המפתח לזיהוי מנגנונים חיסוניים או אימונופתוגניים המושרים על ידי הצלבה של מארח-פתוגן, כמו גם זיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות. קולטנים רבים מתווכים את הזיהוי ו/או ההפנמה של M. tuberculosis, כולל TLRs 6,7,8, NLRs 7,8, קולטני משלים 6,8, קולטני לקטין מסוג C 6,8 וקולטני נבלות 6,8. נתונים מצטברים מצביעים על כך שגם PRRs הקשורים לפני השטח וגם תוך-תאיים ממלאים תפקיד חשוב במהלך ההדבקה, בזיהוי M. tuberculosis אופסוני ולא אופסוני.

Zihad ו-Sifat et al. סקרו לאחרונה את השתתפות ה-PRRs בתגובות הנגרמות על ידי M. tuberculosis על ידי תאים מולדים9. בפרט, רוב בני משפחת TLR היו מעורבים באינטראקציה עם ליגנדים של M. tuberculosis 6,7. Surface TLR2 מזהה אנטיגנים מיקובקטריאליים כגון ליפופרוטאינים אצילטים, ליפופרוטאין 19-kDa, ליפופרוטאין LprA, ליפופרוטאין LprG, אנטיגן 30-kDa, אנטיגן 38-kDa, MymA, חומצה פרולין-פרולין-גלוטמית (PPE)-57, LAM, LM, PIM, חלבון הלם חום 60, חלבון חתימה Rv1509 והחלבון המופרש ESAT-67. ממברנה TLR4 מקיימת אינטראקציה עם חלבוני הלם חום, אנטיגן 38-kDa, RpfE, Rv0652, Rv0335c, Rv2659c, Rv1738, Rv2627c, Rv2628, GrpE ו-HBHA. מצד שני, ליגנדים עבור TLRs אנדוזומיים (TLR 3, 7, 8 ו-9) כוללים dsRNA, tRNA, ssRNA, RNA פגוזומי ו-dsDNA של M. tuberculosis. בנוסף, ל-TLR2 יש תפקיד פעיל בהתחלת תגובות חיסוניות כאשר הוא פועל בשילוב עם TLR1 ו-TLR6, TLR4 ו-TLR9 6,7. NOD2 ו-NLRP3 הם ה-NLRs הציטופלזמיים המאופיינים ביותר בשחפת. למרות שהליגנדים הספציפיים שלהם עדיין במחקר, קולטנים אלה מופעלים על ידי מורמיל דיפפטיד או ESAT-6, בהתאמה 7,8. קולטני לקטין מסוג C מעורבים באופן קלאסי באנדוציטוזיס של M. tuberculosis. בעוד ש-Dectin-2 פועל כ-PRR ישיר ל-ManLAM של דופן התא של M. tuberculosis, ליגנד Dectin-1 עדיין לא התגלה8. מינקל ו-MCL שניהם מזהים את הגליקוליפיד טרהלוז-6,6′-דימיקולט (TDM), הנקרא גם פקטור חבל הטבור7. DCAR מקיים אינטראקציה עם הגליקוליפידים המיקובקטריאליים פוספטידיל-מיו-אינוזיטול מנוזידים (PIMs)7. CR3 מזהה LAM ו-PIM, DC-SIGN קושר את ManLAM, MR מזהה מספר מרכיבי M. tuberculosis, כולל ManLAM, PIM, LM, גליקופרוטאין 38-kDa, אנטיגן 19-kDa וחלבונים מנוסיליים אחרים בעוד שליגנד DCIR עדיין לא מזוהה.

CLRs מסיסים כוללים SP-A, המזהה ManLam, LM, גליקופרוטאין 60-kDa וגליקופרוטאין Apa; SP-D באינטראקציה עם LAM, LM ו-PILAM; ו-MBL, המתמחה בזיהוי ManLAM 6,7. קולטני נבלות הם גם PRRs פגוציטים. ל-SR-A ו-MARCO יש TDM כליגנד שלהם, SR-B1 מזהה ESAT-6, ו-CD36 קושר את ManLAM ו-LM 7,8. בנוסף, Dectin-1, Mincle ו-MARCO יכולים גם להשתלב עם TLR2 או TLR4 כדי להפעיל אותות לאחר זיהוי Pamps של M. tuberculosis 6,7. CD14 הוא קולטן פני השטח שיש לו את היכולת להפנים חיידקים לא אופסוניים ומזהה גם את חלבון הלם החום Chaperonin 60.1. בפרט, CD14 מתפקד כקולטן משותף יחד עם MARCO ו-TLR26. AIM2 הוא קולטן ציטוזולי שיכול לחוש ssDNA כאשר M. tuberculosis בורח מהפאגוזום8. לבסוף, AhR הוא גורם שעתוק המופעל על ידי ליגנד הקושר את גורם האלימות הפיגמנטי נפתוקינון פתיוקול מ-M. tuberculosis6.

רבות מהאינטראקציות שתוארו לעיל הוצגו ולא הוכחו במדויק. אפילו הליגנדים של קולטנים מסוימים נותרו לא ידועים, מה שמחזק את הצורך להבין טוב יותר את תחום הזיהוי החיסוני של M. tuberculosis. בהקשר זה, המולקולה הקוסטימולטורית SLAMF1 (מולקולת הפעלה לימפוציטית איתות) תוארה לאחרונה כקולטן M. tuberculosis על ידי Barbero et al.10. בכך שהוא פועל לא רק כמולקולת איתות אלא גם כחיישן שחפת, ל-SLAMF1 יש תפקיד מסקרן במיוחד בשחפת. SLAMF1 יכול לגרום להפעלה של תאי חיסון על ידי ויסות פונקציות הגנה כגון ייצור IFN-γ על ידי תאי T באמצעות זרחון Erk/CREB 11,12,13, אוטופגיה בנויטרופילים 14 ופינוי חיידקים במקרופאגים15.

אינטראקציות קולטנים-ליגנדים נחקרו לאורך השנים באמצעות טכניקות כגון ELISA, תהודה פלזמון פני השטח (SPR), קלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC), קיטוב פלואורסצנטי (FP), קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), תרמופורזיס בקנה מידה מיקרו (MST), העברת אנרגיית תהודה (למשל, BRET או FRET), מיקרוסקופיה קונפוקלית, מיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (Cryo-EM) ומיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. חלק מהגישות הללו מרמזות על שימוש בגנים מדווחים, חלבונים רקומביננטיים מסומנים או מולקולות כימריות, מודלים של נוק-אאוט, נוקדאון או ביטוי יתר. לחלופין, כלים חישוביים יכולים לחזות אינטראקציות קולטן-ליגנד ואתרי קשירה ומשמשים לעתים קרובות בשילוב עם גישות ביולוגיות כדי להשיג הבנה מקיפה של האינטראקציות 29,30,31. כאן מתוארות שתי חלופות לזיהוי אינטראקציה ביוכימית וגם סעיף על איך לתייג חיידקים פלואורסצנטיים. מוצג פרוטוקול המאפשר לחקור אינטראקציות קולטן-פתוגן במבחנה, במיוחד הערכת מעורבות השחפת SLAMF1-M. באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית, שתי טכניקות זמינות בדרך כלל ונמצאות בשימוש שגרתי.

Protocol

כל ההליכים הכוללים מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים בוצעו בהתאם להצהרת הלסינקי (2013) ובהסכמה עם ועדת האתיקה של UNNOBA (COENOBA). הסכמה מדעת בכתב הושגה לפני איסוף הדגימה. התפלגות קבוצת הזכר/נקבה הייתה 13/6, והגיל החציוני היה 32 שנים, עם טווח בין-רבעוני (IQR) של 18-75 שנים. נוכחות של פתולוגיות קודמות, מחלות נלוות או אבחנה חיובית לשחפת הוגדרו כקריטריונים לאי-הכללה. פרטי הריאגנטים והציוד מפורטים בטבלת החומרים.

1. תרבית וגירוי מקרופאגים שמקורם במונוציטים

  1. לקיחת דם
    1. השג 60 מ"ל דם מתורמים בריאים על ידי ניקור ורידים במזרק הפריני.
      הערה: שאיבת דם חייבת להתבצע על ידי ביוכימאי או טכנאי פלבוטומיה.
    2. השליכו את המחט למיכל סילוק החדים וכל חומר שהיה במגע עם דם התורמים במיכל הפסולת הפתולוגית.
  2. בידוד מונוציטים ויצירת מקרופאגים
    1. העבירו בזהירות את הדם לצינורות של 50 מ"ל ודללו אותו בחצי בתמיסת מלח.
    2. בצע צנטריפוגה על גבי מדיה שיפוע צפיפות כדי להשיג תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC).
    3. אספו את ה-PBMCs מההילה הלבנה.
    4. בצע שתי שטיפות עם תמיסת מלח ב-400 x גרם למשך 10 דקות ושטיפה אחרונה ב-200 x גרם למשך 15 דקות ב-20 מעלות צלזיוס כדי למנוע טסיות דם.
    5. קבע את מספר ה-PBMCs בתא ספירת תאים ובצע בחירה מגנטית חיובית CD14 עם חרוזי CD14.
      הערה: במהלך הבחירה המגנטית, עקוב בקפידה אחר הוראות היצרן. בנוסף, ניתן לבדוק את טוהר המונוציטים המבודדים באמצעות ציטומטריית זרימה.
    6. השעו מחדש את התאים המבודדים ב-RPMI 1640 וקבעו את מספר המונוציטים בתא ספירת תאים.
    7. זרע 500 מיקרוליטר של 1 × 106 / מ"ל CD14 חיובי מונוציטים נבחרים לבאר בצלחת תרבית תאים של 24 בארות בהיעדר סרום כדי לקדם הדבקות.
    8. לאחר שעתיים, הסר תאים שאינם נדבקים על ידי שטיפתם עם RPMI 1640 מחומם מראש.
    9. כדי להבדיל בין מקרופאגים, תרבית את המונוציטים הדבקים למשך 16-18 שעות נוספות (לילה) ב-1 מ"ל של חומר שלם (מדיום RPMI 1640 בתוספת L-גלוטמין, 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 U/mL של פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין).
    10. למחרת, שנה את מדיום התרבות. הסר את המדיום, שטוף עם 1 מ"ל של 1x PBS והוסף 1 מ"ל של מדיה שלמה.
    11. לעורר את המקרופאגים עם M. tuberculosis סוניקציה (M. tuberculosis antigens (Ags)) למשך 24 שעות. השתמש ב-10 מיקרוליטר של M. tuberculosis Ags (10 מיקרוליטר = 1 × 106 חיידקים) לכל 1 × 106 מקרופאגים שמקורם במונוציטים.
      הערה: 10 מיקרוליטר של M. tuberculosis Ags (Mtb Ags) = 1 × 106 חיידקים, מכומת על ידי OD 600ננומטר בספקטרופוטומטר בהתחשב ב-OD של 1 כ-1 x 108 חיידקים/מ"ל. השתמש בארונות בטיחות ביולוגית BSL2 ובחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה עם 5% CO2 לכל שלבי התרבית.
  3. אימות ביטוי SLAMF1
    1. אוספים את המקרופאגים מבאר אחת. הניחו את צלחת התרבות על משטח קר. נתק את התאים באמצעות תנועות למעלה ולמטה על ידי הוספת 1 מ"ל של FACS קר (1x PBS + 2% FBS) פעמיים ברציפות. השתמש בצינור תחתון עגול ציטומטרי לאוסף.
    2. צנטריפוגה את התאים ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט על ידי השלכתו.
    3. צבעו את התאים בנוגדני SLAMF1 אנטי-אנושי מצומד פלואורופור למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך. מערבולת לאחר הוספת 1.25 מיקרוליטר של הנוגדן.
    4. שטפו את התאים כדי לחסל את עודפי הנוגדנים באמצעות FACS, השעו מחדש את הגלולה ב-FACS ורכשו את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה.
      הערה: 1.25 מיקרוליטר של נוגדן נגד SLAMF1 מתאים ל-0.0625 מיקרוגרם המשמש לתיוג 0.5 x 106 מקרופאגים. עם זאת, מומלץ מאוד לבצע טיטרציה של הנוגדן, כמו גם לבצע את האיזוטיפ המתאים או בקרת פלואורסצנציה מינוס אחת (FMO).

2. הכנת תמצית חלבון תאים כוללת

  1. הכנת מאגר ליזה
    1. הכן מאגר רדיו אימונו-משקעים (RIPA) עם NaCl 150 מ"מ, טריס 10 מ"מ, EDTA 5 מ"מ, SDS 1%, טריטון X-100 1% ונתרן דאוקסיכולאט 1%.
    2. תוסף את מאגר RIPA עם 1 מ"מ פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) ומעכבי פרוטאז כגון פפסטין A ולאופפטין.
  2. איסוף תאים ובידוד חלבונים
    1. השלך RPMI שלם מבארות הצלחת באמצעות פיפטה P1000 וקצור מקרופאגים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם PBS 1x קר.
    2. העבירו את התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. אסוף באר אחת לכל מיקרו-צינור.
    3. צנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט.
    4. הוסף 1 מ"ל PBS קר וחזור על שלבים 2.2.2 ו- 2.2.3 ואיסוף התאים באותו צינור מיקרו-צנטריפוגה.
    5. השעו מחדש את כדורי התא ב-100 מיקרוליטר של 1x PBS ואגדו ארבעה צינורות. חזור על שלב 2.2.3. כל צינור יכיל 2 x 106 מקרופאגים.
    6. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר RIPA בתוספת ודגירה על התרחיף על קרח למשך שעה, מערבולת כל 10 דקות.
    7. צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 15 דקות. אוספים את הסופרנטנט ושומרים עד לשימוש ב-20 מעלות צלזיוס.

3. אינטראקציה של M. tuberculosis -SLAMF1 על ידי ציטומטריית זרימה

  1. חלבונים-חיידקים צולבים
    1. דגרו 1 × 106 תאי M. tuberculosis מושבתים שלמים (WCMtb, M. tuberculosis מושבת על ידי קרינת גמא) עם תמצית חלבון מ-1 x 106 מקרופאגים (50 מיקרוליטר) למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במחזיק מיקרו-צינור מסתובב.
      הערה: 10 מיקרוליטר של WCMtb = 1 × 106 חיידקים, מכומת על ידי OD 600ננומטר בספקטרופוטומטר בהתחשב ב-OD של 1 כ-1 x 108 חיידקים/מ"ל.
    2. למחרת, הוסף 500 מיקרוליטר של פורמלדהיד 1% מדולל ב-1x PBS. יש לדגור למשך 15 דקות תחת תסיסה (שייקר) בטמפרטורת החדר (RT).
    3. הוסף 25 מיקרוליטר של 0.125 M גליצין מדולל במים. דגירה למשך 5 דקות תחת תסיסה (שייקר) ב-RT.
    4. שטפו פעמיים עם 1 מ"ל של 1x PBS ב-14,000 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט בין שלבי הכביסה.
    5. השעו מחדש את הגלולה ודגרו את התרחיף ב-500 מיקרוליטר של 2 מ"מ של אתילן גליקול ביס (סוקסינימידיל סוקסינט) (EGS) קרוסלינקר מדולל בתערובת של 1:1 של חומצה אצטית קרחון: מים למשך שעה אחת ב-RT.
      הערה: הכנת הריאגנטים בזמן השימוש מומלצת מאוד. כדי להכין את ה-EGS, יש לערבב חומצה אצטית קרחונית ומים בפרופורציות שוות ולחמם ל-70 מעלות צלזיוס. אם התמיסה אינה חמה, ה-EGS אינו מושעה לחלוטין.
  2. SLAMF1 מכתים
    1. חזור על שלב 3.1.4 באמצעות 500 מיקרוליטר של 1x PBS בכביסה הראשונה ו-1 מ"ל בשנייה.
    2. צבעו את קומפלקס החלבון-חיידקים למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך עם נוגדן SLAMF1 אנטי-אנושי (כמו בשלב 1.3.3) על ידי הוספת הנוגדן למיקרו-צינור ומערבולת. השתמש בכמות הנוגדנים המתאימה ל-1 x 106 תאים (2.5 מיקרוליטר או 0.125 מיקרוגרם).
    3. שטפו את התאים כדי לחסל את עודפי הנוגדנים באמצעות FACS, השעו מחדש את הגלולה ב-FACS ורכשו את הדגימה בציטומטר זרימה (כמו בשלב 1.3.4).
      הערה: בצע את בקרת האיזוטיפ או ה-FMO המתאימה.

4. תיוג אנטיגנים של M. tuberculosis

  1. יש להשעות מחדש את רודמין B באתנול בריכוז מלאי של 5 מ"ג/מ"ל (פי 1000). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. הוסף 1 מיקרוליטר של רודמין B לכל 100 מיקרוליטר של M. tuberculosis Ags בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  3. דגירה למשך 45 דקות ב-RT תחת תסיסה מתמשכת (מערבולת).
  4. יש לשטוף לפחות 3 פעמים בחום של 14,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס באמצעות 1 מ"ל של 1x PBS עד שהסופרנטנט שקוף. הגלולה (Mtb-R Ags) תיראה ורודה בהירה.
  5. השהה מחדש את ה-Mtb-R Ags ב-100 מיקרוליטר של 1x PBS כדי לשחזר את הנפח הראשוני.
    הערה: מומלץ לעבוד בתנאים סטריליים. ודא שהצביעה מתבצעת מיד לפני ביצוע ניסויים.

5. אינטראקציה של M. tuberculosis -SLAMF1 על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. קישור צולב חיידקים-חלבונים
    1. הכניסו כיסויים עגולים בגודל 12 מ"מ לצלחות תרבית של 24 בארות (כיסוי אחד לבאר) באמצעות פינצטה כירורגית עם אף עגול.
      הערה: נקה היטב את הכיסויים עם 70% אתנול. אם תרצה, ניתן לבצע חיטוי או לעקר אותם באור UV למשך 30 דקות.
    2. דגרו את הכיסוי עם 400 מיקרוליטר של 10 מיקרוגרם/מ"ל פולי-D-ליזין למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור.
    3. למחרת, הוציאו את הצלחת מהמקרר ושטפו את הכיסוי פעמיים עם 1 מ"ל מים.
    4. תן לכיסוי להתייבש.
    5. לדלל 20 מיקרוליטר (2 x 106) של Mtb-R Ags ב-180 מיקרוליטר של 1x PBS. 200 מיקרוליטר האחרונים מספיקים בכדי לכסות לחלוטין את הכיסוי.
    6. דגרו את הכיסוי עם Mtb-R Ags למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס בחממת תאים.
    7. השליכו את הנוזל הנותר ושטפו פעמיים עם 1 מ"ל של 1x PBS.
      הערה: בשלב זה ניתן לבדוק את ההידבקות הנכונה של Mtb-R לכיסוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המסננים המתאימים לתעלה האדומה.
    8. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר חוסם (10% FBS ב-1x PBS) למשך 30 דקות ב-RT בתסיסה (שייקר).
    9. יש לשטוף פעמיים עם 400 מיקרוליטר של מאגר חוסם.
    10. דגירה עם 100 מיקרוליטר של תמצית חלבון מדוללת ב-300 מיקרוליטר של 1x PBS למשך שעתיים ב-RT בערבוב (שייקר).
    11. הוסף 400 מיקרוליטר של פורמלדהיד 1% מדולל ב-1x PBS. דגירה למשך 15 דקות תחת תסיסה (שייקר) ב-RT.
    12. הוסף 500 מיקרוליטר גליצין 0.125 M מדולל במים. דגירה למשך 5 דקות תחת תסיסה (שייקר) ב-RT.
    13. יש לשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של 1x PBS.
    14. הוסף 400 מיקרוליטר של 2 מ"מ EGS למשך שעה אחת ב-RT בתסיסה (שייקר).
    15. חזור על שלב 5.1.13
      הערה: הכנת הריאגנטים בזמן השימוש מומלצת מאוד.
  2. SLAMF1 מכתים
    1. עטפו את מכסה צלחת התרבות בניילון פרפין.
    2. הוסף טיפה של 60 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני אנטי-SLAMF1 (דילול של 1:75) על המכסה המכוסה בסרט פרפין.
    3. הסר בזהירות את הכיסוי מהצלחת באמצעות פינצטה ומחטים כירורגיות מעוקלות בעלות קצה עדין.
      הערה: כדי להקל על הסרת החלקות הכיסוי, ניתן לכופף את המחט בזווית של כ-45°.
    4. הפוך את הכיסוי מעל הטיפה המכילה את הנוגדן. דגירה למשך 30 דקות ב-RT בחושך.
    5. הרם את הכיסוי ושטוף פעמיים עם המאגר החוסם.
    6. הפוך את הכיסוי מעל טיפה חדשה המכילה את הנוגדן המשני (דילול של 1:200). דגירה למשך 30 דקות ב-RT בחושך.
    7. חזור על שלב 5.2.5.
    8. הסר את עודפי הנוזל והרכיב את הכיסוי על טיפת נוזל הרכבה המונחת על מגלשת זכוכית.
    9. התבונן תחת מיקרוסקופ הקרינה באמצעות מסננים מתאימים.
      הערה: מומלץ לעבוד בתנאים סטריליים. לדלל את הנוגדנים במאגר החוסם. טפל בזהירות בכיסוי כדי למנוע שריטות שעלולות להפריע להתבוננות במיקרוסקופ. מומלץ מאוד להשתמש בנוזל הרכבה המתאים לפלואורסצנטיות.

תוצאות

בעבודה הזו מסופק פרוטוקול שמאפשר להעריך את האינטראקציה של M. tuberculosis עם הקולטן החיסוני SLAMF1 במקרופאגים אנושיים (איור 1). לשם כך הושג דם היקפי מתורמים בריאים. לאחר מכן, PBMCs הופרדו על ידי צנטריפוגה על פני מדיית שיפוע הצפיפות, והמונוציטים בודדו על ידי ברירה ...

Discussion

מחקר זה מספק מדריך שימושי לחקר האינטראקציה הביוכימית בין M. tuberculosis וחיישנים מיקרוביאליים המתבטאים במקרופאגים אנושיים, סוג תא מפתח המעורב בתגובת המארח במהלך שחפת. הפרוטוקולים שיסופקו יהיו רלוונטיים לפענוח מולקולות הממלאות תפקיד בכניסת M. tuberculosis לפגוציטים.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי האוניברסיטה הלאומית של נורואסטה דה לה פרובינציה של בואנוס איירס (מספרי מענק SIB 0618/2019, SIB 2582/2012 לסמנכ"ל), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, מספרי מענק PICT-2012-2459 ו-PICT A 2017-1896 לסמנכ"ל ו-PICT-2021-I-INVI-00584 ל-A.B.); קרן פלורנסיו פיוריני; ו-Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, מספר מענק PIO 15720150100010CO ל-V.P.). אנו מודים לנטליה מניטה ולגסטון וילאפאנה על התמיכה הטכנית. אנו מודים לד"ר פאולה בארינואבו ולד"ר לוסיאנה בלבואה על הדיון המדעי במהלך הפרסום שהוליד את פיתוח המבחנים שהוצגו בעבודה זו. לבסוף אנו מודים לד"ר אסטרמן על עצתו לגבי פרוטוקולי קישור צולב, ליק. מורוני על עצתו בעבודה עם פולי-ליזין וליק. מוריקוני על עזרתו במספרים סכמטיים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 secondary antibodyInvitrogenA21121For fluorescence microscopy
anti-SLAMF1 FITC antibody eBioscience11-1509-42For flow cytometry
anti-SLAMF1 PE antibody BioLegend306308For flow cytometry
anti-SLAMF1 primary antibody BioLegend306302For fluorescence microscopy
Aqua-Poly/MountPolysciences18606-20Mounting media
CD14 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-097-052For monocytes isolation
Coverslips 12mmHDA-For interaction assay by microscopy
EGSThermoFisher Scientific 21565For crosslinking treatment
FACSCanto IIBD Biosciences338960Flow cytometer with BD FACSDiva software
Fetal Bovine Serum Natocor-Inactivated and irradiated, for macrophages culture
Ficoll-Paque PLUSCytiva17144003For PBMCs separation
Fiji/ImageJOpen Source software-For micrographs analysis
FlowJo 7.6.2 Tree Star-For flow cytometry analysis
FormaldehydeMerckK47740803613For crosslinking treatment
Glass slidesGlass Klass-For interaction assay by microscopy
GlycineSigmaG8898For crosslinking treatment
Imager.A2Carl Zeiss430005-9901-000Fluorescence microscope with Colibri 7 illumination module
iMarkBIO-RAD1681130Microplate absorbance reader 
L-glutamineSigma Aldrich49419For macrophages culture
M. tuberculosis, strain H37Rv, gamma-irradiated whole cells BEI Resources, NIAID, NIHNR-14819For interaction assay
M. tuberculosis, strain H37Rv, whole cell lysateBEI Resources, NIAID, NIHNR-14822For macrophages stimulation and interaction assay
Neofuge 13RHeal ForceNeofuge 13RHigh Speed Refrigerated Centrifuge for protein extraction
Penicillin/StreptomycinGibco15140122For macrophages culture
PMSFThermoFisher Scientific36978For proteins isolation
Poly-D-LysineSigma AldrichA-003-MFor coverslips treatment
Protease Inhibitor CocktailSigma Aldrich P8340For proteins isolation
Rhodamine B Sigma Aldrich 21955For M. tuberculosis staining
RPMI 1640Gibco11875093For macrophages culture
Sorvall ST 16/16R centrifugeThermoFisher Scientific75004240For PBMCs and monocytes isolation

References

  1. . Global Tuberculosis Report 2023 Available from: https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2023)
  2. Ahmad, F., et al. Macrophage: A cell with many faces and functions in tuberculosis. Front Immunol. 13, 882130 (2022).
  3. Bo, H., et al. Mycobacterium tuberculosis-macrophage interaction: Molecular updates. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1187205 (2023).
  4. Papp, A. C., et al. AmpliSeq transcriptome analysis of human alveolar and monocyte-derived macrophages over time in response to Mycobacterium tuberculosis infection. PLoS One. 13 (5), e0198069 (2018).
  5. Zhai, W., Wu, F., Zhang, Y., Fu, Y., Liu, Z. The immune escape mechanisms of Mycobacterium tuberculosis. Int J Mol Sci. 20 (2), 340 (2019).
  6. Van Crevel, R., Ottenhoff, T. H. M., Van der Meer, J. W. M. Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 294-309 (2002).
  7. Mortaz, E., et al. Interaction of pattern recognition receptors with Mycobacterium tuberculosis. J Clin Immunol. 35 (1), 1-10 (2015).
  8. Stamm, C. E., Collins, A. C., Shiloh, M. U. Sensing of Mycobacterium tuberculosis and consequences to both host and bacillus. Immunol Rev. 264 (1), 204-219 (2015).
  9. Zihad, S. M. N. K., et al. Role of pattern recognition receptors in sensing Mycobacterium tuberculosis. Heliyon. 9 (10), e20636 (2023).
  10. Barbero, A. M., et al. SLAMF1 signaling induces Mycobacterium tuberculosis uptake leading to endolysosomal maturation in human macrophages. J Leukoc Biol. 109 (8), 257-273 (2021).
  11. Pasquinelli, V., et al. Expression of signaling lymphocytic activation molecule-associated protein interrupts IFN-γ production in human tuberculosis. J Immunol. 172 (2), 1177-1185 (2004).
  12. Pasquinelli, V., et al. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinases contributes to interferon-γ production in response to Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (2), 340-350 (2012).
  13. Pasquinelli, V., et al. IFN-γ production during active tuberculosis is regulated by mechanisms that involve IL-17, SLAM, and CREB. J Infect Dis. 199 (5), 661-665 (2009).
  14. Pellegrini, J. M., et al. Neutrophil autophagy during human active tuberculosis is modulated by SLAMF1. Autophagy. 17 (2), 423-426 (2021).
  15. Song, T., Dong, C., Xiong, S. Signaling lymphocyte-activation molecule SLAMF1 augments mycobacteria BCG-induced inflammatory response and facilitates bacterial clearance. Int J Med Microbiol. 305 (6), 572-580 (2015).
  16. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor-ligand interaction. J Vis Exp. (132), e57032 (2018).
  17. Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterization of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 43-55 (2014).
  18. Draczkowski, P., Matosiuk, D., Jozwiak, K. Isothermal titration calorimetry in membrane protein research. J Pharm Biomed Anal. 87, 296-304 (2014).
  19. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  20. García-Nafría, J., Tate, C. G. Cryo-electron microscopy: Moving beyond X-ray crystal structures for drug receptors and drug development. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 60, 51-71 (2020).
  21. Asami, J., Shimizu, T. Structural and functional understanding of the toll-like receptors. Protein Sci. 30 (4), 761-772 (2021).
  22. Phạm, T. T. T., Rainey, J. K. On-cell nuclear magnetic resonance spectroscopy to probe cell surface interactions. Biochem Cell Biol. 99 (6), 683-692 (2021).
  23. El Deeb, S., et al. Microscale thermophoresis as a powerful growing analytical technique for the investigation of biomolecular interaction and the determination of binding parameters. Methods Appl Fluoresc. 10 (4), 045001 (2022).
  24. El Khamlichi, C., et al. Bioluminescence resonance energy transfer as a method to study protein-protein interactions: Application to G protein-coupled receptor biology. Molecules. 24 (3), 505 (2019).
  25. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods Enzymol. 545, 103-125 (2014).
  26. Park, A. M. W., Schirmer, P. S. H. Atomic force microscopy: A multifaceted tool to study membrane proteins and their interactions with ligands. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 74-89 (2014).
  27. Zalejski, J., Sun, J., Sharma, A. Unravelling the mystery inside cells by using single-molecule fluorescence imaging. J Imaging. 9 (9), 183 (2023).
  28. Zheng, S., Zou, M., Shao, Y., Wu, H., Wang, X. Two-dimensional measurements of receptor-ligand interactions. Front Mol Biosci. 10, 1075587 (2023).
  29. Zlotnikov, I. D., Kudryashova, E. V. Computer simulation of the receptor-ligand interactions of mannose receptor CD206 in comparison with the lectin concanavalin A model. Biochemistry (Moscow). 87 (1), 54-69 (2022).
  30. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: A case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 2018, 7604567 (2018).
  31. Farina, B., et al. A novel approach for studying receptor-ligand interactions on living cells' surface by using NUS/T1ρ-NMR methodologies combined with computational techniques: The RGDechi15D-αvβ5 integrin complex. Comput Struct Biotechnol J. 19, 3303-3318 (2021).
  32. Driessen, N. N., et al. Role of phosphatidylinositol mannosides in the interaction between mycobacteria and DC-SIGN. Infect Immun. 77 (10), 4538-4547 (2009).
  33. Bansal, K., et al. Src homology 3-interacting domain of Rv1917c of Mycobacterium tuberculosis induces selective maturation of human dendritic cells by regulating PI3K-MAPK-NF-κB signaling and drives Th2 immune responses. J Biol Chem. 285 (47), 36511-36522 (2010).
  34. Xu, Y., et al. PPE57 induces activation of macrophages and drives Th1-type immune responses through TLR2. J Mol Med. 93 (6), 645-662 (2015).
  35. Olesen, R., et al. DC-SIGN (CD209), pentraxin 3 and vitamin D receptor gene variants associate with pulmonary tuberculosis risk in West Africans. Genes Immun. 8, 456-467 (2007).
  36. Berger, S. B., et al. SLAM is a microbial sensor that regulates bacterial phagosome functions in macrophages. Nat Immunol. 11 (10), 920-927 (2010).
  37. Degos, C., et al. Omp25-dependent engagement of SLAMF1 by Brucella abortus in dendritic cells limits acute inflammation and favours bacterial persistence in vivo. Cell Microbiol. 22 (4), e13156 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SLAMF1PED

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved