离体胰岛治疗和细胞凋亡测量

摘要

本研究利用基于多染色荧光的细胞死亡和凋亡标志物结合共聚焦显微镜来评估细胞因子诱导的胰岛细胞凋亡和β细胞特异性死亡。它揭示了细胞死亡和细胞凋亡在细胞外刺激下的空间和时间变化。

摘要

本研究使用荧光染色技术和共聚焦显微镜相结合来评估细胞活力、细胞凋亡和β细胞特异性死亡，研究促炎细胞因子对胰岛，特别是产生胰岛素的β细胞的影响。用不同浓度的细胞因子混合物（包括 TNF-α、IL-1β 和 IFN-γ）处理分离的小鼠胰岛，以模拟 1 型糖尿病发展过程中免疫介导的细胞凋亡。使用 FDA/PI 双重染色评估胰岛细胞的活力，其中 FDA 转化为荧光素表示有活力的细胞，PI 标记膜受损细胞。YOPRO-1 和细胞核染色提供了有关细胞凋亡的额外数据，其中 Annexin-V 证实了早期凋亡细胞。定量分析显示，细胞因子处理的胰岛细胞凋亡和细胞死亡率显著增加。为了专门评估对 β 细胞的影响，使用 Zn²⁺ 选择性指示剂染色通过胰岛素颗粒中的锌缔合标记产生胰岛素的细胞，揭示用促炎细胞因子处理胰岛 24 小时后出现大量β细胞丢失。这些多染色方案可有效捕获和量化细胞因子诱导的胰岛损伤程度，并可用于评估旨在预防早期 1 型糖尿病β细胞凋亡的治疗方法。

引言

胰岛，也称为朗格汉斯胰岛，是位于胰腺内的内分泌细胞的集合。产生胰岛素的 β 细胞是胰岛最丰富且功能最重要的成分。这些β细胞分泌胰岛素，胰岛素是一种在维持葡萄糖稳态中起关键作用的激素¹。在 1 型糖尿病 （T1D） 中，免疫系统靶向并浸润胰岛，破坏产生胰岛素的 β 细胞。这种自身免疫性攻击主要由促炎细胞因子介导，包括白细胞介素-1β （IL-1β）、肿瘤坏死因子-α （TNF-α） 和干扰素-γ （IFN-γ）²。这些细胞因子在β细胞内启动一连串信号转导事件，最终触发细胞凋亡³。细胞凋亡，即程序性细胞死亡，是一个受到严格调节的过程，涉及 caspase 的激活、DNA 片段化和细胞崩解。它导致 T1D³ 发作期间β细胞质量和功能的逐渐丧失。

了解驱动 β 细胞凋亡的分子机制对于确定预防或减轻 T1D 中β细胞破坏的策略至关重要。为了实现这一目标，从实验模型或人类尸体中分离的胰岛可以作为研究β细胞病理学的强大且成熟的模型系统 ^2,3。通过用促炎细胞因子处理这些分离的胰岛，研究人员可以复制早期 T1D 特征的环境，从而可以详细研究体外β细胞功能障碍和死亡 ^4,5。这些实验为β细胞在疾病相关条件下的脆弱性和存活提供了关键见解，它们还可以作为测试旨在保护或挽救 β 细胞免受细胞因子诱导细胞凋亡的治疗干预的平台。通过利用这种体外系统，我们可以有效地分析来自不同物种的胰岛如何响应各种条件，从而更好地了解不同物种的功能和凋亡变异。

先前的研究表明，小鼠和人胰岛分别用小鼠和人源细胞因子的混合物（1x = 10 ng/mL TNF-α、5 ng/mL IL-1β 和 100 ng/mL IFN-γ）处理 24 小时，导致胰岛细胞显着死亡 ^4,5,6。通过用荧光素二乙酸酯 （FDA） 和碘化丙啶 （PI） 对细胞因子处理的细胞进行染色来确认胰岛活力^5,6。在全球范围内，使用 FDA 和 PI⁷ 的标准脱氧核糖核酸 （DNA） 结合染料排除技术评估胰岛活力。荧光染色剂或染料偶联底物根据膜完整性和通透性评估细胞活力。FDA 是一种细胞渗透性染料，被活细胞转化为绿色荧光（荧光素）。相比之下，PI 是一种非细胞渗透性染料，仅对膜受损的死细胞的细胞核进行染色⁷。然后在共聚焦显微镜上通过双色成像分析细胞，其中绿色和红色荧光灯分别标记活细胞和死细胞。

FDA/PI 染色方案的局限性在于 PI 仅进入失去膜选择性的细胞，这意味着它无法区分早期凋亡细胞。此外，这种方法不能区分细胞亚群，因此不适合选择性评估β细胞活力。Annexin V/ PI 方案通常用于研究凋亡细胞，并且该方案已经过修改以提高其准确性⁸。细胞凋亡的早期阶段涉及磷脂酰丝氨酸从质膜内层到外层的易位。Annexin V 是一种钙依赖性蛋白，以高亲和力与这种暴露的磷脂酰丝氨酸结合。PI 染色与膜联蛋白-V 一起进行，以区分凋亡细胞（仅膜联蛋白 V 阳性）和坏死细胞（膜联蛋白-V 和 PI 均阳性），因为坏死细胞也因膜完整性受损而显示磷脂酰丝氨酸⁹。其他染料，如 YOPRO-1，也用于定量胰岛细胞的凋亡。与膜联蛋白-V 不同，活细胞的细胞膜对 YOPRO-1 不渗透，后者不能量化正在凋亡的活细胞。

为了评估胰腺 β 细胞死亡，需要仅针对产生胰岛素的细胞的特异性染料。胰腺 β 细胞的一个显著特征是细胞内 Zn²⁺ 的一部分以 Zn²⁺-胰岛素复合物（2：1 比例）¹⁰ 的形式储存在囊泡中。游离 Zn²⁺ 也作为储层存在于β胞周围的晶外空间中。使用锌结合染料可以观察到分泌颗粒中与胰岛素松散结合的游离 Zn²⁺ 和 Zn²⁺。Dithizone 是一种锌结合染料，通常用于评估胰岛纯度，但不能与用于评估β细胞活力和功能的荧光染料结合使用¹¹。已经开发出对 Zn²⁺ 具有高度选择性的 TSQ 和 Zinquin 等紫外线探针，通过对游离细胞内 Zn²⁺ 进行成像和测量来定量β细胞^;12,13.然而，它们的使用受到溶解度差、细胞负载不均匀、紫外线激发要求和区室化为酸性囊泡的限制¹⁴。可见光波长荧光探针，如 Newport green 和 Zn²⁺ 选择性指示剂，也被开发出来以克服这些限制，现在广泛用于检测离体人胰岛中的 β 细胞^15,16。FluoZin-3（Zn²⁺ 选择性指示剂）比 Newport Green 具有更高的 Zn²⁺ 亲和力和卓越的量子产率，并且已被证明可有效成像 Zn²⁺ 与胰岛素在离体胰岛中共释放的^{Zn 14,17}。

使用 FDA、PI、Annexin V、YOPRO-1 和 Zn²⁺ 选择性指示剂等荧光染料可以测量和区分活细胞、凋亡细胞和总死细胞。结合相容性和高选择性探针还为评估和定量β细胞活力和细胞凋亡提供了一种靶向方法，这对于理解和减轻糖尿病研究和药物开发中的β细胞破坏至关重要。

研究方案

所有小鼠实验均已获得科罗拉多大学丹佛机构动物护理和使用委员会 （协议 000929） 的批准。用于该实验的 C57Bl/6 小鼠购自杰克逊实验室，并饲养在温控设施中，进行 12 小时的光照/黑暗循环，可随意获取食物和水。分离的小鼠胰岛是使用胶原酶消化方案获得的，该方案已在前面描述过 ^5,18。

1. 溶液和培养基的制备

注：培养基、细胞因子储备液和其他试剂应在无菌条件下制备。

1. 向 500 mL 1640 RPMI 培养基中加入 10% 胎牛血清 （FBS）、10,000 U/mL 青霉素和 10,000 μg/mL 链霉素，制备胰岛培养基。
2. 制备 1x 磷酸盐缓冲盐水溶液 （PBS），pH 7.4。在含有 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的无菌 PBS 中制备 1000x 小鼠细胞因子混合物、10 μg/mL TNF-α 10 μg/mL、5 μg/mL IL-1β 和 100 μg/mL IFN-γ 储备液，并将溶液分装在 -20 °C 下储存在 10 μL 等分试样中。
3. 在丙酮中制备 46 μM （50x） FDA 储备液，并将其分 1 mL 等分试样储存在 -20°C 下。 在 PBS 中制备 1.434 mM （50x） PI 储备液，并将其分 1 mL 等分试样储存在 4 °C 下。
4. 在 500 mL dH₂O 中制备 500 mL 碳酸氢盐改性的 Krebs-Henseleit HEPES （BMHH） 缓冲液，其中含有 125 mM NaCl、5.7 mM KCl、2.5 mM CaCl₂、1.2 mM MgCl₂ 和 10 mM HEPES。将 pH 调节至 7.4。
5. 在 100 mL dH₂O 中制备 100 mL Annexin-V 结合缓冲液，其中含有 10 mM HEPES、140 mM NaCl 和 2.5 mM CaCl₂。将 pH 调节至 7.4。
6. 在 DMSO 中制备 1 mM Zn²⁺ 选择性指示剂储备液，并在 -20 °C 下以 10 μL 等分试样储存。
   注：荧光染料对光敏感，因此必须在黑暗中储存和孵育。

2. 用细胞因子处理离体胰岛

1. 用 10 μL 微量移液器将小鼠胰岛分离到培养基中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育过夜，以便在用细胞因子处理之前从分离应激中恢复。
2. 将 2 mL 灭菌的胰岛培养基添加到 35 mm 未经组织培养处理的培养皿中，并适当标记它们以区分细胞因子处理和未处理的无细胞因子培养皿。
3. 对于细胞因子处理的培养皿，从储备液中取出 6 μL 培养基，并用 2 μL 每种细胞因子替换，得到最终相对细胞因子浓度为 10 ng/mL、5 ng/mL IL-1β 和 100 ng/mL IFN-γ （1x RCC）。
   注：通过分别以 1：1 和 1：9 的比例稀释含有 0.1% BSA 的无菌 PBS 储备液，可以制备 0.5 倍和 0.1 倍的较低 RCC。
4. 在分离后 12 小时至 24 小时，在光学显微镜下使用微量移液管拾取 10-20 个胰岛并转移到培养皿中，并在加湿的 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 24 小时。
   注意：孵育时间可能因具体实验目标而异。

3. 使用 FDA/PI 进行胰岛活力测量

1. 将 20 μL FDA 和 PI 储备液分别添加到 960 μL 含有 0.1% BSA 的 BMHH 缓冲液中，分别得到 0.46 μM 和 14.34 μM 的荧光染料终浓度。
2. 将 100 μL 染色溶液分装到 7 mm 玻璃底非组织培养处理的培养皿中。
3. 在与细胞因子孵育后 24 小时，小心地将每个处理的至少 6 个胰岛转移到玻璃底培养皿中。在室温下避光孵育 5 - 10 分钟（用铝箔纸覆盖）。
4. 使用带有 40 倍水浸物镜的荧光显微镜拍摄图像。在 FDA/PI 染色后 15 分钟内拍摄图像。
5. 使用 488 nm 和 514 nm 的激发激光分别检测 FDA （520 nm） 和 PI （620 nm） 的荧光发射。
6. 图像胰岛作为 z 堆栈，由三个图像组成，相距 10 μm。仅对胰岛底部 1/3 - 1/2 进行成像，以减少由于胰岛中的光散射问题而导致的信号损失。
7. 在 ImageJ （NIH） 中手动计数每只小鼠至少 5 个胰岛的活绿色（FDA 阳性）和死红色（PI 阳性）细胞 （n = 3）。计算细胞死亡的百分比如下：
   胰岛死亡百分比 = 死细胞数 / （死细胞数 + 活细胞数） x 100%

4. 使用染色法测量细胞凋亡

1. 将 8 μL 的 YOPRO-1（1 mM 溶液）添加到 992 μL 的 BMHH 成像缓冲液中，终浓度为 0.8 μM。
2. 将 500 μL 染色溶液分装到 14 mm 玻璃底非组织培养处理的培养皿中。
3. 在与细胞因子孵育后 24 小时，小心地将每个处理中的至少 6 个胰岛转移到玻璃底培养皿中，并在 37 °C 下在黑暗中孵育 1 小时（用箔纸覆盖）。
4. 孵育 20 分钟后，向每个玻璃底培养皿中加入一滴 NucBlue（细胞核染色剂，20 μL）并继续孵育。YOPRO-1 的总孵育时间为 1 小时，核染色的总孵育时间为 40 分钟。
5. 孵育 1 小时后，将胰岛转移到含有 0.1% BSA （100 μL） 的新鲜 BMHH 成像缓冲液中，溶于 7 mm 玻璃底非组织培养处理的培养皿中。
6. 使用带有 40 倍水浸物镜的荧光显微镜拍摄图像。使用 405 nm 和 488 nm 的激发激光分别检测核染色 （460 nm） 和 YOPRO-1 （509 nm） 的荧光发射。
7. 图像胰岛作为 z 堆栈，由三个图像组成，相距 10 μm。仅对胰岛底部 1/3 - 1/2 进行成像，以减少由于胰岛中的光散射问题而导致的信号损失。
8. 在 ImageJ （NIH） 中手动计数活蓝色（核染色阳性）和凋亡绿色（YOPRO-1 阳性）细胞，每只小鼠至少 5 个胰岛 （n = 3）。计算凋亡胰岛细胞的百分比如下：
   凋亡胰岛细胞的百分比 = 凋亡细胞的数量 / （凋亡细胞的数量 + 活细胞的数量） x 100%

5. 使用 Annexin V/细胞核染色法进行细胞凋亡测量

1. 将 2 滴细胞核染色剂 （40 μL） 添加到 1 mL 膜联蛋白结合缓冲液中。将 100 μL 溶液分装到 7 mm 玻璃底非组织培养处理的培养皿中。
2. 在与细胞因子孵育后 24 小时，通过使用 10 μl 微量移液器上下移液 3 次，在 PBS 中上下吹打至少 6 个胰岛 3 次，小心冲洗。将胰岛转移到装有核染色溶液的玻璃底培养皿中，并在37°C下在黑暗中孵育40分钟（用箔纸覆盖）。
3. 孵育 25 分钟后，向每个玻璃底培养皿中加入 5 μL Annexin V Alexa Flour 488 偶联物并继续孵育。细胞核染色的总孵育时间为 40 分钟，膜联蛋白 V 的总孵育时间为 15 分钟。
4. 孵育 40 分钟后，将胰岛转移到 7 mm 玻璃底培养皿中的新鲜 BMHH 成像缓冲液（无膜联蛋白 V 或核染色）中。
5. 使用带有 40 倍水浸物镜的荧光显微镜拍摄图像。使用 405 nm 和 488 nm 的激发激光分别检测核染色剂 （460 nm） 和 Annexin V 偶联物 （515 nm） 的荧光发射。
6. 图像胰岛作为 z 堆栈，由三个图像组成，相距 10 μm。仅对胰岛底部 1/3 - 1/2 进行成像，以减少由于胰岛中的光散射问题而导致的信号损失。
7. 在 ImageJ （NIH） 中手动计数活蓝色（核染色阳性）和凋亡绿色（膜联蛋白 V 阳性）细胞，每只小鼠至少 5 个胰岛 （n = 3）。计算凋亡胰岛细胞的百分比如下：
   凋亡细胞百分比 = 凋亡细胞数量 / （凋亡细胞数量 + 活细胞数量） x 100%

6. 使用 Zn²⁺ 选择性指示剂/细胞核染色/PI 测量 β 细胞死亡

1. 将 2 μL Zn^{2 +} 选择性指示剂 AM 储备液添加到 998 μL BMHH 成像缓冲液中，使终浓度为 0.2 μM。将 500 μL 染色溶液分装到 14 mm 玻璃底非组织培养处理的培养皿中。
2. 在与细胞因子孵育后 24 小时，小心地将每个处理的至少 6 个胰岛转移到玻璃底培养皿中。在 37 °C 下在黑暗中与 Zn^{2 +} 选择性指示剂 AM 溶液（用箔纸覆盖）孵育 1 小时。
3. 孵育 20 分钟后，按照制造商的说明向每个玻璃底培养皿中加入一滴核染色剂 （20 μl） 并继续孵育。Zn²⁺ 选择性指示剂的总孵育时间为 1 小时，核染色的总孵育时间为 40 分钟。
4. 孵育 1 小时后，将胰岛转移到含有 0.1% BSA （100 μL） 的新鲜 BMHH 成像缓冲液中，溶于 7 mm 玻璃底非组织培养处理的培养皿中。加入 2 μL PI 储备液 10 分钟，使终浓度为 20 μg/mL。
5. 使用带有 40 倍水浸物镜的荧光显微镜在 PI 染色后 15 分钟内拍摄图像。使用 405 nm、488 nm 和 514 nm 的激发激光分别检测核染色 （460 nm）、Zn²⁺ 选择性指示剂 （516 nm） 和 PI （620 nm） 的荧光发射。
6. 图像胰岛作为 z 堆栈，由三个图像组成，相距 10 μm。仅对胰岛底部 1/3 - 1/2 进行成像，以减少由于胰岛中的光散射问题而导致的信号损失。
7. 在 ImageJ （NIH） 中手动计数活蓝色（核染色阳性）、锌绿色（Zn^{2 +} 选择性指示剂阳性）和死红色（PI 阳性）细胞，每只小鼠至少 5 个胰岛 （n = 3）。计算 β 细胞死亡的百分比如下：
   β细胞死亡百分比 = 锌阳性和 PI 阳性细胞数 / （死亡数 + 活胰岛细胞数） x 100%
   或
   β细胞死亡百分比 = 锌阳性细胞和 PI 阳性细胞数 / （锌阳性细胞数） x 100%

结果

FDA 和 PI 双重染色用于评估细胞因子处理胰岛的活力。所有实验一式三份 （n = 3） 进行，数据由相距 10 μm 的多个 z 堆栈图像生成，每个重复包含来自 5 或 6 个胰岛的平均数据，以确保处理和未处理胰岛之间的可重复性和统计比较。 图 1A 显示来自未处理对照组的健康胰岛由于酶活性细胞将 FDA 转化为荧光素而表现出明显的绿色荧光。红色荧光的缺失...

讨论

本研究证明了荧光染料和共聚焦显微镜的多染色方法在细胞因子诱导的压力下评估胰岛细胞活力、细胞凋亡和β细胞存活的有效性。FDA/PI 染色显示暴露于细胞因子的胰岛内细胞死亡呈剂量依赖性增加，红色荧光标记膜受损细胞证明了这一点，证实了细胞因子对细胞活力的细胞毒作用。FDA/PI 染色还可以识别人胰岛中的活细胞和死细胞，从而对人胰岛制备活力进行快速定性?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mm glass-bottom Petri dish	Mattek	P35G-1.5-14-C
1640 RPMI	Corning	10-041-CV
35 mm Petri dish	Celltreat	229638
7 mm glass-bottom Petri dish	Mattek	P35G-1.5-7-C
Annexin V, Alexa Flour 488	Thermo Fisher (Invitrogen)	A13201	ex488/em515
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher	C79
Dimethyl Sulfoxide Anhydrous	Sigma	276855
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher (Gibco)	26140079
Flouzin-3, AM	Thermo Fisher (Invitrogen)	F24195	ex488/em516
Fluorescein Diacetate (FDA)	Thermo Fisher (Invitrogen)	F1303	ex488/em520
HEPES	Sigma	54457
Image processing software	NIH	ImageJ
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Thermo Fisher (Invitrogen)	R37605	ex360/em460
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher (Gibco)	15-140-122
Phosphate-buffered Saline Tablets	Fisher	BP2944-100
Potassium Chloride, Granular	Macron	6858-04
Propidium iodide	Thermo Fisher (Invitrogen)	P1304MP	ex535/em620
Protein Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI-100/CF
Recombinant Mouse IL-1 beta/IL-1F2	R&D Systems	401-ML-100/CF
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein	R&D Systems	410-MT-100/CF
Sodium Chloride, Crystal	Macron	7581-12
Stellaris Confocal microcope with spectral detectors	Leica	DMI-8	40x water immersion objective.
Yopro-1 Iodide	Thermo Fisher (Invitrogen)	Y3603	ex488/em509