JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה משתמש בסמנים מבוססי פלואורסצנטיות מרובי כתמים של מוות תאים ואפופטוזיס בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך אפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים ומוות ספציפי לתאי β באיי הלבלב. הוא חושף שינויים מרחביים וזמניים במוות תאים ואפופטוזיס בתגובה לגירויים חוץ-תאיים.

Abstract

מחקר זה חוקר את ההשפעה של ציטוקינים פרו-דלקתיים על איי הלבלב, במיוחד תאי β המייצרים אינסולין, תוך שימוש בשילוב של טכניקות צביעה פלואורסצנטיות ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך את כדאיות התאים, אפופטוזיס ומוות ספציפי לתאי β. איי עכברים מבודדים טופלו בריכוזים משתנים של קוקטייל ציטוקינים, כולל TNF-α, IL-1β ו-IFN-γ, כדי לחקות אפופטוזיס בתיווך חיסוני במהלך התפתחות סוכרת מסוג 1. הכדאיות של תאי איים הוערכה באמצעות צביעה כפולה של ה-FDA/PI, כאשר המרת ה-FDA לפלואורסצאין הצביעה על תאים ברי קיימא, ותאים מסומנים ב-PI שנפגעו ממברנה. YOPRO-1 וצביעה גרעינית סיפקו נתונים נוספים על אפופטוזיס, כאשר Annexin-V אישר תאים אפופטוטיים מוקדמים. ניתוח כמותי חשף עלייה משמעותית בשיעורי האפופטוזיס ותמותת התאים באיים שטופלו בציטוקין. כדי להעריך באופן ספציפי את ההשפעות על תאי β, נעשה שימוש בצביעה סלקטיבית של Zn2+ כדי לתייג תאים מייצרי אינסולין באמצעות אסוציאציה של אבץ בגרגירי אינסולין, וחשף אובדן תאי β משמעותי לאחר טיפול באיים עם ציטוקינים פרו-דלקתיים במשך 24 שעות. פרוטוקולים מרובי צביעה אלה לוכדים ומכמתים ביעילות את היקף הנזק הנגרם על ידי ציטוקינים באיים וניתן להשתמש בהם כדי להעריך טיפולים שנועדו למנוע אפופטוזיס של תאי β בסוכרת מסוג 1 מוקדמת.

Introduction

איי הלבלב, הידועים גם בשם איי לנגרהנס, הם אוסף של תאים אנדוקריניים הממוקמים בתוך הלבלב. תאי β המייצרים אינסולין הם המרכיב הנפוץ והמשמעותי ביותר מבחינה תפקודית באיי הלבלב. תאי β אלה מפרישים אינסולין, הורמון הממלא תפקיד קריטי בשמירה על הומאוסטזיס גלוקוז1. בסוכרת מסוג 1 (T1D), מערכת החיסון מכוונת ומסתננת לאיי הלבלב, והורסת תאי β המייצרים אינסולין. התקפה אוטואימונית זו מתווכת בעיקר על ידי ציטוקינים מעודדי דלקת, כולל אינטרלוקין-1β (IL-1β), גורם נמק גידול-אלפא (TNF-α) ואינטרפרון-גמא (IFN-γ)2. ציטוקינים אלה יוזמים מפל של אירועי איתות בתוך תאי β שבסופו של דבר מעוררים אפופטוזיס3. אפופטוזיס, מוות תאי מתוכנת, הוא תהליך מוסדר היטב הכולל הפעלה של קספאזות, פיצול DNA והתפוררות תאים. הוא תורם לאובדן הדרגתי של מסת תאי β ותפקודם במהלך הופעת T1D3.

הבנת המנגנונים המולקולריים המניעים אפופטוזיס של תאי β היא קריטית לזיהוי אסטרטגיות למניעה או להפחתת הרס תאי β ב-T1D. כדי להשיג זאת, איי לבלב מבודדים ממודלים ניסיוניים או גופות אנושיות משמשים כמערכת מודל חזקה ומבוססת לחקר פתולוגיה של תאי β 2,3. על ידי טיפול באיים מבודדים אלה עם ציטוקינים פרו-דלקתיים, חוקרים יכולים לשכפל את הסביבה המאפיינת את T1D המוקדם, מה שמאפשר מחקר מפורט של תפקוד לקוי של תאי β ומוות במבחנה 4,5. ניסויים אלה מספקים תובנות מפתח לגבי הפגיעות וההישרדות של תאי β בתנאים הקשורים למחלה, והם משמשים גם כפלטפורמה לבדיקת התערבויות טיפוליות שמטרתן להגן או להציל תאי β מאפופטוזיס המושרה על ידי ציטוקינים. על ידי שימוש במערכת מבחנה זו, אנו יכולים לנתח ביעילות כיצד איים ממינים שונים מגיבים לתנאים שונים, ולספק הבנה טובה יותר של וריאציות תפקודיות ואפופטוטיות בין מינים.

מחקרים קודמים הראו כי איים עכברים ובני אדם שטופלו במשך 24 שעות בקוקטייל (1x = 10 ננוגרם/מ"ל TNF-α, 5 ננוגרם/מ"ל IL-1β ו-100 ננוגרם/מ"ל IFN-γ) של ציטוקינים שמקורם בעכברים ובבני אדם, בהתאמה, הביאו למוות משמעותי של תאי איים 4,5,6. כדאיות האי אושרה על ידי צביעת התאים שטופלו בציטוקינים בפלואורסצאין דיאצטט (FDA) ופרופידיום יודיד (PI)5,6. ברחבי העולם, כדאיות האיים מוערכת באמצעות טכניקת אי הכללת הצבע הסטנדרטית של חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) עם ה-FDA ו-PI7. כתמים פלואורסצנטיים או מצעים מצומדים בצבע מעריכים את כדאיות התא על סמך שלמות הממברנה וחדירות הממברנה. ה-FDA, צבע חדיר לתאים, מומר על ידי תאים חיים לפלואורסצנטיות ירוקה (פלואורסצאין). לעומת זאת, PI, צבע שאינו מתאים לתאים, מכתים רק את גרעיני התאים המתים עם ממברנות פגועות7. לאחר מכן מנותחים התאים באמצעות הדמיה דו-צבעונית במיקרוסקופ קונפוקלי, שבו פלואורסצנטים ירוקים ואדומים מסמנים תאים ברי קיימא ותאים מתים, בהתאמה.

המגבלה של פרוטוקול הצביעה של ה-FDA/PI היא ש-PI נכנס רק לתאים שאיבדו את סלקטיביות הממברנה, מה שאומר שהוא לא יכול להבחין בתאים אפופטוטיים מוקדמים. יתר על כן, שיטה זו אינה יכולה להבדיל בין תת-קבוצות תאים, מה שהופך אותה לבלתי מתאימה להערכה סלקטיבית של כדאיות תאים β. פרוטוקול Annexin V/PI משמש בדרך כלל לחקר תאים אפופטוטיים, והפרוטוקול שונה כדי לשפר את הדיוק שלו8. השלבים המוקדמים של אפופטוזיס כוללים העברה של פוספטידילסרין מהשכבה הפנימית לשכבה החיצונית של קרום הפלזמה. אנקסין V, חלבון תלוי סידן, נקשר עם זיקה גבוהה לפוספטידילסרין החשוף הזה. צביעה עם PI מתבצעת לצד annexin-V כדי להבחין בין תאים אפופטוטיים (חיובי ל-annexin-V בלבד) לבין תאים נמקיים (חיוביים הן ל-annexin-V והן ל-PI), שכן תאים נמקיים מציגים גם פוספטידילסרין עקב פגיעה בשלמות הממברנה9. צבעים אחרים, כגון YOPRO-1, משמשים גם לכימות אפופטוזיס של תאי אי. קרום התא של תאים ברי קיימא אטום ל-YOPRO-1, בניגוד ל-annexin-V, שאינו יכול לכמת תאים חיים שעוברים אפופטוזיס.

כדי להעריך מוות של תאי β בלבלב, יש צורך בצבעים ספציפיים המכוונים רק לתאים המייצרים אינסולין. מאפיין מובהק של תאי β הלבלב הוא שחלק מ-Zn2+ תוך-תאי מאוחסן בשלפוחיות כקומפלקס אינסולין Zn2+ (יחס 2:1)10. Zn2+ חופשי קיים גם במרחב החוץ-גרגירי סביב β התאים כמאגרים. ניתן לדמיין Zn2+ ו-Zn2+ הקשורים באופן רופף לאינסולין בגרגירי הפרשה באמצעות צבעים קושרי אבץ. דיתזון, צבע קושר אבץ, משמש בדרך כלל להערכת טוהר האיים, אך לא ניתן לשלב אותו עם צבעים פלואורסצנטיים המשמשים להערכת כדאיות ותפקוד של תאי β11. בדיקות UV כמו TSQ ו-Zinquin שהן סלקטיביות מאוד כלפי Zn2+ פותחו כדי לכמת תאי β על ידי הדמיה ומדידה של Zn2+ תוך-תאי חופשי; 12,13. עם זאת, השימוש בהם מוגבל על ידי מסיסות ירודה, העמסת תאים לא אחידה, דרישת עירור UV ומידור לשלפוחיות חומציות14. בדיקות פלואורסצנטיות באורך גל גלוי, כגון Newport green ו-Zn2+ מחוון סלקטיבי, פותחו גם הם כדי להתגבר על מגבלות אלו וכיום נמצאים בשימוש נרחב לאיתור תאי β באיים אנושיים מבודדים15,16. ל-FluoZin-3 (אינדיקטור סלקטיבי Zn2+) יש זיקה גבוהה יותר של Zn2+ ותפוקה קוונטית מעולה מאשר ניופורט גרין והוכח כיעיל להדמיית Zn2+ בשחרור משותף עם אינסולין באיים מבודדים14,17.

שימוש בצבעים פלואורסצנטיים כמו FDA, PI, Annexin V, YOPRO-1 ו-Zn2+ מאפשר מדידה והבחנה בין תאים מתים ברי קיימא, אפופטוטיים וכוללים. שילוב בדיקות תואמות וסלקטיביות ביותר מציע גם שיטה ממוקדת להערכה וכימות של כדאיות תאי β ואפופטוזיס, שהיא קריטית להבנה והפחתת הרס תאי β במחקר סוכרת ופיתוח תרופות.

Protocol

כל הניסויים בעכברים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קולורדו דנבר (פרוטוקולים 000929). עכברי C57Bl/6 ששימשו לניסוי זה נרכשו ממעבדת ג'קסון ושוכנו במתקן מבוקר טמפרטורה במחזור אור/חושך של 12 שעות עם גישה למזון ומים אד ליביטום. איי העכברים המבודדים הושגו באמצעות פרוטוקול עיכול הקולגנאז, שתואר בעבר 5,18.

1. הכנת פתרונות ומדיה תרבותית

הערה: יש להכין אמצעי תרבית, מלאי ציטוקינים וריאגנטים אחרים בתנאים סטריליים.

  1. הכן מדיום תרבית איים על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 10,000 U/mL פניצילין ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ל-500 מ"ל של 1640 RPMI Medium.
  2. הכן תמיסת מלח 1x חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4. הכינו תמיסת מלאי פי 1000 של קוקטייל ציטוקינים של עכברים, 10 מיקרוגרם/מ"ל TNF-α 10 מיקרוגרם/מ"ל, 5 מיקרוגרם/מ"ל IL-1β ו-100 מיקרוגרם/מ"ל IFN-γ ב-PBS סטרילי המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ואחסנו את התמיסה ב-10 מיקרוליטר ב-20 מעלות צלזיוס.
  3. הכן תמיסת מלאי של 46 מיקרומטר (פי 50) של ה-FDA באצטון ואחסן אותה ב-1 מ"ל ב-20 מעלות צלזיוס. הכן תמיסת מלאי PI של 1.434 מ"מ (פי 50) ב-PBS ואחסן אותה ב-1 מ"ל ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. הכן 500 מ"ל של מאגר קרבס-הנסלייט HEPES (BMHH) שונה בביקרבונט עם 125 מ"מ NaCl, 5.7 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl2, 1.2 מ"מ MgCl2 ו-10 מ"מ HEPES ב-500 מ"ל של dH2O. התאם את ה-pH ל-7.4.
  5. הכן 100 מ"ל של מאגר קשירה Annexin-V עם 10 מ"מ HEPES, 140 מ"מ NaCl ו-2.5 מ"מ CaCl2 ב-100 מ"ל של dH2O. התאם את ה-pH ל-7.4.
  6. הכן 1mM Zn2+ פתרון מלאי אינדיקטור סלקטיבי ב-DMSO ואחסן ב-10 מיקרוליטר ב-20 מעלות צלזיוס.
    הערה: צבעי פלורסנט רגישים לאור, ולכן האחסון והדגירה חייבים להיות בחושך.

2. טיפול באיים מבודדים עם ציטוקינים

  1. בודדו איי עכברים עם מיקרופיפטה של 10 מיקרוליטר לתוך מדיום התרבות ודגרו למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 כדי להתאושש מלחץ בידוד לפני הטיפול בציטוקינים.
  2. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית האיים המעוקר לצלחות פטרי 35 מ"מ שאינן מטופלות בתרבית רקמות וסמן אותן כראוי כדי להבדיל בין כלים שטופלו בציטוקינים ולא טופלו ללא ציטוקינים.
  3. עבור כלים שטופלו בציטוקין, הסר 6 מיקרוליטר של מדיום תרבית והחלף אותו ב-2 מיקרוליטר מכל ציטוקין מתמיסת המלאי כדי לתת ריכוז ציטוקינים יחסי סופי של 10 ננוגרם/מ"ל, 5 ננוגרם/מ"ל IL-1β ו-100 ננוגרם/מ"ל IFN-γ (1x RCC).
    הערה: ניתן להכין RCC תחתון של 0.5x ו-0.1x על ידי דילול תמיסות מלאי עם PBS סטרילי המכיל 0.1% BSA ב-1:1 ו-1:9, בהתאמה.
  4. ב-12 שעות עד 24 שעות לאחר הבידוד, יש להרים 10-20 איים באמצעות מיקרופיפטה תחת מיקרוסקופ אור ולהעביר לכלים ולדגור בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות.
    הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם למטרות הניסוי הספציפיות.

3. מדידת כדאיות האיים עם ה-FDA/PI

  1. הוסף 20 מיקרוליטר כל אחת מתמיסות מלאי ה-FDA וה-PI ל-960 מיקרוליטר של מאגר BMHH המכיל 0.1% BSA כדי לתת ריכוז סופי של 0.46 מיקרומטר ו-14.34 מיקרומטר של הצבעים הפלואורסצנטיים, בהתאמה.
  2. יש להפחית 100 מיקרוליטר מתמיסת הצביעה לצלחת פטרי שאינה מטופלת בתרבית רקמות עם תחתית זכוכית בגודל 7 מ"מ.
  3. 24 שעות לאחר הדגירה עם ציטוקינים, העבירו בזהירות לפחות 6 איים מכל טיפול לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית. דוגרים למשך 5 - 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך (מכסים בנייר כסף).
  4. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם יעד טבילה במים פי 40. צלם תמונות תוך 15 דקות מרגע הצביעה של ה-FDA/PI.
  5. השתמש בלייזרי עירור ב-488 ננומטר ו-514 ננומטר כדי לזהות את פליטות הקרינה עבור ה-FDA (520 ננומטר) ו-PI (620 ננומטר), בהתאמה.
  6. איי תמונה כערימת z המורכבת משלוש תמונות, במרחק של 10 מיקרומטר זו מזו. דמיין רק את 1/3 - 1/2 התחתון של האי כדי להפחית את אובדן האות עקב בעיות פיזור אור באי.
  7. ספור תאים ירוקים חיים (חיוביים ל-FDA) ואדומים מתים (חיוביים ל-PI) באופן ידני ב-ImageJ (NIH) עבור לפחות 5 איים לעכבר (n = 3). חשב את אחוז מוות התאים באופן הבא:
    אחוז המוות של האיים = מספר התאים המתים/ (מספר התאים המתים + מספר התאים החיים) x 100%

4. מדידת אפופטוזיס באמצעות צביעה

  1. הוסף 8 מיקרוליטר של YOPRO-1 (תמיסה של 1 מ"מ) ל-992 מיקרוליטר של מאגר הדמיה BMHH לריכוז סופי של 0.8 מיקרומטר.
  2. Aliquot 500 מיקרוליטר של תמיסת הצביעה לצלחת פטרי שאינה מטופלת בתרבית רקמות עם תחתית זכוכית 14 מ"מ.
  3. לאחר 24 שעות לאחר הדגירה עם ציטוקינים, העבירו בזהירות לפחות 6 איים מכל טיפול לתוך צלחת הפטרי עם תחתית הזכוכית ודגרו למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס בחושך (מכסים בנייר כסף).
  4. לאחר 20 דקות של דגירה, הוסיפו טיפה של NucBlue (כתם גרעיני, 20 מיקרוליטר) לכל צלחת פטרי עם תחתית זכוכית והמשיכו בדגירה. זמן הדגירה הכולל הוא שעה אחת עבור YOPRO-1 ו-40 דקות עבור כתם גרעיני.
  5. לאחר שעה אחת של דגירה, העבירו את האיים למאגר הדמיה טרי של BMHH המכיל 0.1% BSA (100 מיקרוליטר) בצלחת פטרי שאינה מטופלת בתרבית רקמות עם תחתית זכוכית בגודל 7 מ"מ.
  6. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם יעד טבילה במים פי 40. השתמש בלייזרי עירור ב-405 ננומטר ו-488 ננומטר כדי לזהות את פליטות הקרינה של כתם גרעיני (460 ננומטר) ו-YOPRO-1 (509 ננומטר), בהתאמה.
  7. איי תמונה כערימת z המורכבת משלוש תמונות, במרחק של 10 מיקרומטר זו מזו. דמיין רק את 1/3 - 1/2 התחתון של האי כדי להפחית את אובדן האות עקב בעיות פיזור אור באי.
  8. ספור תאים כחולים חיים (חיוביים לכתם גרעיני) וירוק אפופטוטי (חיובי ל-YOPRO-1) באופן ידני ב-ImageJ (NIH) עבור לפחות 5 איים לכל עכבר (n = 3). חשב את אחוז תאי האי האפופטוטי באופן הבא:
    אחוז תאי האי האפופטוטיים = מספר התאים האפופטוטיים / (מספר התאים האפופטוטיים + מספר התאים החיים) x 100%

5. מדידת אפופטוזיס עם נספח V/ כתם גרעיני

  1. הוסף 2 טיפות של כתם גרעיני (40 מיקרוליטר) ל-1 מ"ל של מאגר מחייב אנקסין. הכניסו 100 מיקרוליטר מהתמיסה לצלחת פטרי שאינה מטופלת בתרבית רקמות עם תחתית זכוכית 7 מ"מ.
  2. לאחר 24 שעות לאחר הדגירה עם ציטוקינים, יש לשטוף בזהירות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 3x לפחות 6 איים מכל טיפול ב-PBS על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש פעמים באמצעות מיקרופיפטה של 10 מיקרוליטר. העבירו את האיים לצלחת הפטרי עם תחתית הזכוכית עם תמיסת הכתם הגרעיני ודגרו אותם במשך 40 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך (מכסים בנייר כסף).
  3. לאחר 25 דקות של דגירה, מוסיפים 5 מיקרוליטר של Annexin V Alexa Flour 488 מצומד לכל צלחת פטרי עם תחתית זכוכית וממשיכים בדגירה. זמן הדגירה הכולל הוא 40 דקות עבור הכתם הגרעיני ו-15 דקות עבור נספח V.
  4. לאחר 40 דקות של דגירה, העבירו את האיים למאגר הדמיה BMHH טרי (ללא נספח V או כתם גרעיני) בצלחת פטרי עם תחתית זכוכית בגודל 7 מ"מ.
  5. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם יעד טבילה במים פי 40. השתמש בלייזרי עירור ב-405 ננומטר ו-488 ננומטר כדי לזהות את פליטות הקרינה של כתם גרעיני (460 ננומטר) ומצומד נספח V (515 ננומטר), בהתאמה.
  6. איי תמונה כערימת z המורכבת משלוש תמונות, במרחק של 10 מיקרומטר זו מזו. דמיין רק את 1/3 - 1/2 התחתון של האי כדי להפחית את אובדן האות עקב בעיות פיזור אור באי.
  7. ספור תאים כחולים חיים (חיוביים לכתם גרעיני) וירוק אפופטוטי (חיובי ל-Annexin V) באופן ידני ב-ImageJ (NIH) עבור לפחות 5 איים לעכבר (n = 3). חשב את אחוז תאי האי האפופטוטי באופן הבא:
    אחוז התאים האפופטוטיים = מספר התאים האפופטוטיים / (מספר התאים האפופטוטיים + מספר התאים החיים) x 100%

6. מדידת מוות של β תאים באמצעות מחוון סלקטיבי Zn2+ / כתם גרעיני / PI

  1. הוסף 2 μL של Zn2+ אינדיקטור סלקטיבי תמיסת מלאי AM ל-998 μL של מאגר הדמיה BMHH כדי ליצור ריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר.
  2. 24 שעות לאחר הדגירה עם ציטוקינים, העבירו בזהירות לפחות 6 איים מכל טיפול לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית. דגירה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס בחושך עם תמיסת AM מחוון סלקטיבי Zn2+ (מכסים בנייר כסף).
  3. לאחר 20 דקות של דגירה, הוסיפו טיפה של כתם גרעיני (20 מיקרוליטר) לכל צלחת פטרי עם תחתית זכוכית, לפי הוראות היצרן והמשיכו בדגירה. זמן הדגירה הכולל הוא שעה אחת עבור מחוון סלקטיבי Zn2+ ו -40 דקות עבור כתם גרעיני.
  4. לאחר שעה אחת של דגירה, העבירו את האיים למאגר הדמיה טרי של BMHH המכיל 0.1% BSA (100 מיקרוליטר) בצלחת פטרי שאינה מטופלת בתרבית רקמות עם תחתית זכוכית בגודל 7 מ"מ. הוסף 2 מיקרוליטר של תמיסת מלאי PI למשך 10 דקות כדי ליצור ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל.
  5. צלם תמונות תוך 15 דקות מצביעת ה-PI באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם יעד טבילה במים פי 40. השתמש בלייזרי עירור ב-405 ננומטר, 488 ננומטר ו-514 ננומטר כדי לזהות את פליטות הקרינה של כתם גרעיני (460 ננומטר), מחוון סלקטיבי Zn2+ (516 ננומטר) ו-PI (620 ננומטר), בהתאמה.
  6. איי תמונה כערימת z המורכבת משלוש תמונות, במרחק של 10 מיקרומטר זו מזו. דמיין רק את 1/3 - 1/2 התחתון של האי כדי להפחית את אובדן האות עקב בעיות פיזור אור באי.
  7. ספור תאים כחולים חיים (חיוביים לכתם גרעיני), ירוק אבץ (Zn2+ אינדיקטור סלקטיבי חיובי) ואדום מת (חיובי PI) באופן ידני ב-ImageJ (NIH) עבור לפחות 5 איים לעכבר (n = 3). חשב את אחוז המוות של β תאים באופן הבא:
    אחוז מוות של β תאים = מספר תאים חיוביים לאבץ וחיובי PI / (מספר תאי איים מתים + חיים) x 100%
    או
    אחוז מוות של β תאים = מספר התאים החיוביים לאבץ וחיובי PI / (מספר התאים החיוביים לאבץ) x 100%

תוצאות

הצביעה הכפולה עם ה-FDA וה-PI שימשה להערכת הכדאיות של איים שטופלו בציטוקינים. כל הניסויים נערכו בשלושה עותקים (n = 3), והנתונים הופקו ממספר תמונות z-stack של 10 מיקרומטר זו מזו, כאשר כל שכפול מכיל נתונים ממוצעים מ-5 או 6 איים, כדי להבטיח שחזור והשוואה סטטיסטית בין האיים המטופלים והלא ?...

Discussion

מחקר זה מדגים את היעילות של שיטות רב-צביעה עם צבעים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופיה קונפוקלית בהערכת כדאיות תאי האי, אפופטוזיס והישרדות תאי β תחת לחץ המושרה על ידי ציטוקינים. צביעת ה-FDA/PI חשפה עלייה תלוית מינון במוות התאים בתוך איים שנחשפו לציטוקינים, כפי שניתן לראות על ידי פ?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

המענקים הבאים סיפקו מימון לעבודה זו: פרס NIDDK R01 DK137221, JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B ל-N.L.F., ו-ADA 7-20-JDF-020 ל-N.L.F. המחברים מבקשים להודות לתמיכה מהמרכז לחקר הסוכרת בקמפוס אנשוץ של אוניברסיטת קולורדו P30-DK116073 ומתקני הליבה הקשורים המשמשים לתמיכה בעבודה זו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
14 mm glass-bottom Petri dishMattekP35G-1.5-14-C
1640 RPMICorning10-041-CV
35 mm Petri dishCelltreat229638
7 mm glass-bottom Petri dishMattekP35G-1.5-7-C
Annexin V, Alexa Flour 488Thermo Fisher (Invitrogen)A13201ex488/em515
Calcium Chloride DihydrateFisherC79
Dimethyl Sulfoxide AnhydrousSigma276855
Fetal Bovine SerumThermo Fisher (Gibco)26140079
Flouzin-3, AMThermo Fisher (Invitrogen)F24195ex488/em516
Fluorescein Diacetate (FDA)Thermo Fisher (Invitrogen)F1303ex488/em520
HEPESSigma54457
Image processing softwareNIHImageJ
Magnesium ChlorideSigmaM8266
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)Thermo Fisher (Invitrogen)R37605ex360/em460
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher (Gibco)15-140-122 
Phosphate-buffered Saline TabletsFisherBP2944-100
Potassium Chloride, GranularMacron6858-04
Propidium iodideThermo Fisher (Invitrogen)P1304MPex535/em620
Protein Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D Systems485-MI-100/CF
Recombinant Mouse IL-1 beta/IL-1F2 R&D Systems401-ML-100/CF
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) ProteinR&D Systems410-MT-100/CF
Sodium Chloride, CrystalMacron7581-12
Stellaris Confocal microcope with spectral detectorsLeicaDMI-8 40x water immersion objective.
Yopro-1 IodideThermo Fisher (Invitrogen)Y3603ex488/em509

References

  1. Da Silva Xavier, G. The cells of the islets of Langerhans. J Clinical medicine. 7 (3), 54 (2018).
  2. Grunnet, L. G., et al. Proinflammatory cytokines activate the intrinsic apoptotic pathway in β-cells. Diabetes. 58 (8), 1807-1815 (2009).
  3. Delaney, C. A., Pavlovic, D., Hoorens, A., Pipeleers, D. G., Eizirik, D. c. L. Cytokines induce deoxyribonucleic acid strand breaks and apoptosis in human pancreatic islet cells. Endocrinology. 138 (6), 2610-2614 (1997).
  4. Farnsworth, N. L., et al. Modulation of gap junction coupling within the islet of langerhans during the development of type 1 diabetes. Front Physiol. 13, 913611 (2022).
  5. Collins, J., et al. Cleavage of protein kinase c δ by caspase-3 mediates proinflammatory cytokine-induced apoptosis in pancreatic islets. J Biol Chem. 300 (9), 107611 (2024).
  6. Farnsworth, N. L., Walter, R., Piscopio, R. A., Schleicher, W. E., Benninger, R. K. Exendin-4 overcomes cytokine-induced decreases in gap junction coupling via protein kinase A and Epac2 in mouse and human islets. J Physiol. 597 (2), 431-447 (2019).
  7. NIH CIT Consortium Chemistry Manufacturing Controls Monitoring Committee. Purified human pancreatic islet-viability estimation of islet using fluorescent dyes (FDA/PI): Standard operating procedure of the NIH clinical islet transplantation consortium. CellR4 Repair Replace Regen Reprogram. 3 (1), e1378 (2015).
  8. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V. J Immunol Meth. 184 (1), 39-51 (1995).
  9. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. J Vis Exp. (50), e2597 (2011).
  10. Emdin, S., Dodson, G., Cutfield, J., Cutfield, S. Role of zinc in insulin biosynthesis: some possible zinc-insulin interactions in the pancreatic B-cell. Diabetologia. 19, 174-182 (1980).
  11. ZA, L. A simple method of staining fresh and cultured islets. Transplantation. 45 (4), 827-830 (1988).
  12. Zalewski, P. D., et al. Video image analysis of labile zinc in viable pancreatic islet cells using a specific fluorescent probe for zinc. J Histochem Cytochem. 42 (7), 877-884 (1994).
  13. Jindal, R. M., Taylor, R. P., Gray, D. W., Esmeraldo, R., Morris, P. J. A new method for quantification of islets by measurement of zinc content. Diabetes. 41 (9), 1056-1062 (1992).
  14. Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry A. 73 (7), 615-625 (2008).
  15. Lukowiak, B., et al. Identification and purification of functional human β-cells by a new specific zinc-fluorescent probe. J Histochem Cytochem. 49 (4), 519-527 (2001).
  16. Gee, K. R., Zhou, Z. L., Qian, W. J., Kennedy, R. Detection and imaging of zinc secretion from pancreatic β-cells using a new fluorescent zinc indicator. J Am Chem Soc. 124 (5), 776-778 (2002).
  17. Gyulkhandanyan, A. V., Lee, S. C., Bikopoulos, G., Dai, F., Wheeler, M. B. The Zn2+-transporting pathways in pancreatic β-cells: a role for the L-type voltage-gated Ca2+ channel. J Biol Chem. 281 (14), 9361-9372 (2006).
  18. Chen, J., et al. A murine pancreatic islet cell-based screening for diabetogenic environmental chemicals. J Vis Exp. (136), e57327 (2018).
  19. Farnsworth, N. L., Walter, R. L., Hemmati, A., Westacott, M. J., Benninger, R. K. Low level pro-inflammatory cytokines decrease connexin36 gap junction coupling in mouse and human islets through nitric oxide-mediated protein kinase Cδ. J Biol Chem. 291 (7), 3184-3196 (2016).
  20. Dalle, S., Abderrahmani, A., Renard, E. Pharmacological inhibitors of β-cell dysfunction and death as therapeutics for diabetes. Front Endocrinol. 14, 1076343 (2023).
  21. Collins, J., et al. Peptide-coated polycaprolactone-Benzalkonium chloride nanocapsules for targeted drug delivery to the pancreatic β-Cell. ACS Appl Bio Mater. 7 (10), 6451-6466 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved