Traitement isolé des îlots pancréatiques et mesure de l’apoptose

Résumé

Cette étude utilise des marqueurs de mort cellulaire et d’apoptose basés sur la fluorescence multicoloration, combinés à la microscopie confocale pour évaluer l’apoptose induite par les cytokines et la mort spécifique des cellules β dans les îlots pancréatiques. Il révèle des changements spatiaux et temporels dans la mort cellulaire et l’apoptose en réponse à des stimuli extracellulaires.

Résumé

Cette étude étudie l’effet des cytokines pro-inflammatoires sur les îlots pancréatiques, en particulier les cellules β productrices d’insuline, en utilisant une combinaison de techniques de coloration par fluorescence et de microscopie confocale pour évaluer la viabilité cellulaire, l’apoptose et la mort spécifique des cellules β. Des îlots de souris isolés ont été traités avec des concentrations variables d’un cocktail de cytokines, y compris le TNF-α, l’IL-1β et l’IFN-γ, pour imiter l’apoptose à médiation immunitaire pendant le développement du diabète de type 1. La viabilité des cellules des îlots pancréatiques a été évaluée à l’aide d’une double coloration FDA/PI, où la conversion de la FDA en fluorescéine indiquait des cellules viables et des cellules atteintes de membrane marquées par PI. YOPRO-1 et la coloration nucléaire ont fourni des données supplémentaires sur l’apoptose, l’annexine-V confirmant les cellules apoptotiques précoces. L’analyse quantitative a révélé une augmentation significative des taux d’apoptose et de mort cellulaire dans les îlots traités par des cytokines. Pour évaluer spécifiquement les effets sur les cellules β, la coloration indicatrice sélective Zn²⁺ a été utilisée pour marquer les cellules productrices d’insuline par association de zinc dans les granules d’insuline, révélant une perte substantielle de cellules β après le traitement des îlots avec des cytokines pro-inflammatoires pendant 24 heures. Ces protocoles multicolorations capturent et quantifient efficacement l’étendue des dommages induits par les cytokines dans les îlots de Langerhans et peuvent être utilisés pour évaluer les traitements conçus pour prévenir l’apoptose à cellules β dans le diabète de type 1 précoce.

Introduction

Les îlots pancréatiques, également connus sous le nom d’îlots de Langerhans, sont un ensemble de cellules endocrines situées dans le pancréas. Les cellules β productrices d’insuline sont le composant le plus abondant et le plus important sur le plan fonctionnel des îlots pancréatiques. Ces cellules β sécrètent de l’insuline, une hormone qui joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie^{du glucose 1}. Dans le diabète de type 1 (DT1), le système immunitaire cible et infiltre les îlots pancréatiques, détruisant les cellules β productrices d’insuline. Cette attaque auto-immune est principalement médiée par des cytokines pro-inflammatoires, notamment l’interleukine-1β (IL-1β), le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et l’interféron-gamma (IFN-γ)². Ces cytokines déclenchent une cascade d’événements de signalisation au sein des cellules β qui déclenchent finalement l’apoptose³. L’apoptose, la mort cellulaire programmée, est un processus étroitement régulé impliquant l’activation des caspases, la fragmentation de l’ADN et la désintégration cellulaire. Il contribue à la perte progressive de la masse et de la fonction des cellules β au cours de l’apparition du DT1³.

Comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent l’apoptose des cellules β est essentiel pour identifier des stratégies visant à prévenir ou à atténuer la destruction des cellules β dans le DT1. Pour y parvenir, des îlots pancréatiques isolés à partir de modèles expérimentaux ou de cadavres humains servent de système modèle robuste et bien établi pour l’étude de la pathologie β-cellules ^2,3. En traitant ces îlots isolés avec des cytokines pro-inflammatoires, les chercheurs peuvent reproduire l’environnement qui caractérise le DT1 précoce, ce qui permet d’étudier en détail le dysfonctionnement et la mort des cellules β in vitro ^4,5. Ces expériences fournissent des informations clés sur la vulnérabilité et la survie des cellules β dans des conditions associées à la maladie, et elles servent également de plate-forme pour tester des interventions thérapeutiques visant à protéger ou à sauver les cellules β de l’apoptose induite par les cytokines. En utilisant ce système in vitro, nous pouvons analyser efficacement comment les îlots de différentes espèces réagissent à diverses conditions, ce qui permet de mieux comprendre les variations fonctionnelles et apoptotiques entre les espèces.

Des études antérieures ont montré que des îlots de souris et d’humains traités pendant 24 h avec un cocktail (1x = 10 ng/mL de TNF-α, 5 ng/mL d’IL-1β et 100 ng/mL d’IFN-γ) de cytokines de souris et d’humains, respectivement, ont entraîné une mort significative des cellules des îlots^{pancréatiques 4,5,6}. La viabilité des îlots a été confirmée par la coloration des cellules traitées aux cytokines avec du diacétate de fluorescéine (FDA) et de l’iodure de propidium (PI)^5,6. À l’échelle mondiale, la viabilité des îlots de Langerhans est évaluée à l’aide de la technique standard d’exclusion des colorants liant l’acide désoxyribonucléique (ADN) avec la FDA et PI⁷. Les colorants fluorescents ou les substrats conjugués à un colorant évaluent la viabilité cellulaire en fonction de l’intégrité et de la perméabilité de la membrane. Le FDA, un colorant perméable aux cellules, est converti par les cellules vivantes en fluorescence verte (fluorescéine). En revanche, l’IP, un colorant imperméable aux cellules, ne colore que les noyaux des cellules mortes dont les membranes sont compromises⁷. Les cellules sont ensuite analysées par imagerie bicolore sur un microscope confocal, où les fluorescents verts et rouges marquent respectivement les cellules viables et mortes.

La limitation du protocole de coloration FDA/PI est que l’IP ne pénètre que dans les cellules qui ont perdu la sélectivité membranaire, ce qui signifie qu’il ne peut pas distinguer les cellules apoptotiques précoces. De plus, cette méthode ne peut pas différencier les sous-ensembles de cellules, ce qui la rend inadaptée à l’évaluation sélective de la viabilité des cellules β. Le protocole Annexin V/PI est couramment utilisé pour l’étude des cellules apoptotiques, et le protocole a été modifié pour améliorer sa précision⁸. Les premiers stades de l’apoptose impliquent la translocation de la phosphatidylsérine de la couche interne à la couche externe de la membrane plasmique. L’annexine V, une protéine dépendante du calcium, se lie avec une grande affinité à cette phosphatidylsérine exposée. La coloration avec l’IP, en même temps que l’annexine-V, permet de distinguer les cellules apoptotiques (annexine V-positive uniquement) des cellules nécrotiques (positive pour l’annexine-V et l’IP), car les cellules nécrotiques présentent également de la phosphatidylsérine en raison^{d’une intégrité} membranaire compromise9. D’autres colorants, tels que YOPRO-1, sont également utilisés pour quantifier l’apoptose des cellules des îlots pancréatiques. La membrane cellulaire des cellules viables est imperméable à YOPRO-1, contrairement à l’annexine-V, qui ne peut pas quantifier les cellules vivantes subissant l’apoptose.

Pour évaluer la mort β cellulaire pancréatique, des colorants spécifiques ciblant uniquement les cellules productrices d’insuline sont nécessaires. Une caractéristique distincte des cellules β pancréatiques est qu’une partie de Zn²⁺ intracellulaire est stockée dans les vésicules sous la forme d’un complexe Zn²⁺-insuline (rapport 2:1)¹⁰. Le Zn²⁺ libre existe également dans l’espace extragranulaire autour des cellules β en tant que réservoirs. Le Zn²⁺ et le Zn²⁺ libres faiblement liés à l’insuline dans des granules sécrétoires peuvent être visualisés à l’aide de colorants liant le zinc. La dithizone, un colorant liant le zinc, est couramment utilisée pour évaluer la pureté des îlots de Langerhans, mais elle ne peut pas être combinée avec des colorants fluorescents utilisés pour évaluer la viabilité et la fonction des cellules β¹¹. Des sondes UV comme TSQ et Zinquin qui sont très sélectives envers le Zn²⁺ ont été développées pour quantifier les cellules β par imagerie et mesure du Zn²⁺ intracellulaire libre ^{; 12 et 13}. Cependant, leur utilisation est limitée par une faible solubilité, une charge cellulaire inégale, une exigence d’excitation UV et une compartimentation en vésicules acides¹⁴. Des sondes fluorescentes à longueur d’onde visible, telles que le vert Newport et l’indicateur sélectif Zn²⁺, ont également été développées pour surmonter ces limitations et sont maintenant largement utilisées pour détecter les cellules β dans les îlots humains isolés^15,16. FluoZin-3 (indicateur sélectif Zn²⁺) a une affinité Zn²⁺ plus élevée et un rendement quantique supérieur à Newport Green et s’est avéré efficace pour l’imagerie du Zn²⁺ co-libéré avec l’insuline dans les îlots isolés^14,17.

L’utilisation de colorants fluorescents tels que FDA, PI, Annexin V, YOPRO-1 et l’indicateur sélectif Zn²⁺ permet de mesurer et de différencier les cellules viables, apoptotiques et mortes totales. La combinaison de sondes compatibles et hautement sélectives offre également une méthode ciblée pour évaluer et quantifier la viabilité et l’apoptose des cellules β, ce qui est essentiel pour comprendre et atténuer la destruction des cellules β dans la recherche sur le diabète et le développement de médicaments.

Protocole

Toutes les expériences sur des souris ont été approuvées par le comité institutionnel de l’Université du Colorado à Denver sur le soin et l’utilisation des animaux (protocoles 000929). Les souris C57Bl/6 utilisées pour cette expérience ont été achetées au Jackson Laboratory et logées dans une installation à température contrôlée selon un cycle lumière/obscurité de 12 heures avec accès à la nourriture et à l’eau à volonté. Les îlots de souris isolés ont été obtenus à l’aide du protocole de digestion de la collagénase, qui a été décrit précédemment ^5,18.

1. Préparation des solutions et des milieux de culture

REMARQUE : Les milieux de culture, les stocks de cytokines et autres réactifs doivent être préparés dans des conditions stériles.

1. Préparez un milieu de culture d’îlots pancréatiques en ajoutant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 10 000 U/mL de pénicilline et 10 000 μg/mL de streptomycine à 500 mL de milieu 1640 RPMI.
2. Préparez 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4. Préparer une solution mère 1000x de cocktail de cytokines de souris, 10 μg/mL de TNF-α 10 μg/mL, 5 μg/mL d’IL-1β et 100 μg/mL d’IFN-γ dans un PBS stérile contenant 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) et conserver la solution dans des aliquotes de 10 μL à -20 °C.
3. Préparez une solution mère de 46 μM (50x) de FDA dans de l’acétone et conservez-la dans des aliquotes de 1 mL à -20 °C. Préparer une solution mère de 1,434 mM (50x) d’IP dans du PBS et la stocker dans des aliquotes de 1 mL à 4 °C.
4. Préparez 500 mL de tampon Krebs-Henseleit HEPES (BMHH) modifié au bicarbonate avec 125 mM de NaCl, 5,7 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de MgCl₂ et 10 mM de HEPES dans 500 mL de dH₂O. Ajustez le pH à 7,4.
5. Préparez 100 mL de tampon de liaison Annexin-V avec 10 mM d’HEPES, 140 mM de NaCl et 2,5 mM de CaCl₂ dans 100 mL de dH₂O. Ajustez le pH à 7,4.
6. Préparer une solution mère d’indicateur sélectif de 1 mM de Zn²⁺ dans du DMSO et la conserver dans des aliquotes de 10 μL à -20 °C.
   REMARQUE : Les colorants fluorescents sont sensibles à la lumière, donc le stockage et l’incubation doivent se faire dans l’obscurité.

2. Traitement des îlots isolés par des cytokines

1. Isolez les îlots de souris à l’aide d’une micropipette de 10 μL dans le milieu de culture et incubez pendant la nuit à 37 °C et 5 % de CO₂ pour récupérer du stress d’isolement avant le traitement par cytokines.
2. Ajouter 2 ml de milieu de culture d’îlots de Langerhans stérilisé dans des boîtes de Pétri de 35 mm non traitées par culture tissulaire et les étiqueter de manière appropriée pour différencier les boîtes traitées aux cytokines et celles non traitées sans cytokines.
3. Dans le cas d’une boîte traitée aux cytokines, prélever 6 μL de milieu de culture et le remplacer par 2 μL de chaque cytokine de la solution mère pour obtenir une concentration relative finale de cytokines de 10 ng/mL, 5 ng/mL d’IL-1β et 100 ng/mL d’IFN-γ (1x RCC).
   REMARQUE : Une CCR inférieure de 0,5x et 0,1x peut être préparée en diluant des solutions mères avec du PBS stérile contenant 0,1 % de BSA à 1:1 et 1:9, respectivement.
4. À 12 h à 24 h après l’isolement, prélever 10 à 20 îlots à l’aide d’une micropipette sous microscope optique, les transférer dans les plats et les incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et à 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   REMARQUE : La durée d’incubation peut varier en fonction des objectifs expérimentaux spécifiques.

3. Mesure de la viabilité des îlots de Langerhans avec FDA/PI

1. Ajouter 20 μL de solutions mères FDA et PI à 960 μL de tampon BMHH contenant 0,1 % de BSA pour obtenir une concentration finale de 0,46 μM et 14,34 μM de colorants fluorescents, respectivement.
2. Aliquote 100 μL de la solution de coloration dans une boîte de Pétri à fond de verre de 7 mm non traitée par culture tissulaire.
3. 24 h après l’incubation avec des cytokines, transférez soigneusement au moins 6 îlots de chaque traitement dans la boîte de Pétri à fond de verre. Incuber pendant 5 à 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité (couvrir de papier d’aluminium).
4. Prenez des images à l’aide de la microscopie à fluorescence avec un objectif d’immersion dans l’eau 40x. Prenez des images dans les 15 minutes suivant la coloration FDA/PI.
5. Utilisez des lasers d’excitation à 488 nm et 514 nm pour détecter les émissions de fluorescence pour FDA (520 nm) et PI (620 nm), respectivement.
6. Îlots d’images sous la forme d’une pile z composée de trois images, espacées de 10 μm. N’imagez que le 1/3 - 1/2 inférieur de l’îlot pour réduire la perte de signal due aux problèmes de diffusion de la lumière dans l’îlot.
7. Comptez manuellement les cellules vertes vivantes (positives pour la FDA) et rouges mortes (PI positives) dans ImageJ (NIH) pour au moins 5 îlots par souris (n = 3). Calculez le pourcentage de mort cellulaire comme suit :
   Pourcentage de mort des îlots de Langerhans = Nombre de cellules mortes/ (nombre de cellules mortes + nombre de cellules vivantes) x 100 %

4. Mesure de l’apoptose par coloration

1. Ajouter 8 μL de YOPRO-1 (solution de 1 mM) à 992 μL de tampon d’imagerie BMHH pour une concentration finale de 0,8 μM.
2. Aliquote 500 μL de la solution de coloration dans une boîte de Pétri à fond de verre de 14 mm non traitée par culture tissulaire.
3. 24 h après l’incubation avec des cytokines, transvaser soigneusement au moins 6 îlots de chaque traitement dans la boîte de Pétri à fond de verre et incuber pendant 1 h à 37 °C dans l’obscurité (couvrir d’une feuille d’aluminium).
4. Après 20 min d’incubation, ajoutez une goutte de NucBlue (colorant nucléaire, 20 μL) dans chaque boîte de Pétri à fond de verre et poursuivez l’incubation. Le temps total d’incubation est de 1 h pour YOPRO-1 et de 40 min pour la coloration nucléaire.
5. Après 1 h d’incubation, transférer les îlots dans un tampon d’imagerie BMHH frais contenant 0,1 % de BSA (100 μL) dans une boîte de Pétri à fond de verre de 7 mm non traitée par culture tissulaire.
6. Prenez des images à l’aide de la microscopie à fluorescence avec un objectif d’immersion dans l’eau 40x. Utilisez des lasers d’excitation à 405 nm et 488 nm pour détecter les émissions de fluorescence de la coloration nucléaire (460 nm) et de YOPRO-1 (509 nm), respectivement.
7. Îlots d’images sous la forme d’une pile z composée de trois images, espacées de 10 μm. N’imagez que le 1/3 - 1/2 inférieur de l’îlot pour réduire la perte de signal due aux problèmes de diffusion de la lumière dans l’îlot.
8. Compter manuellement les cellules bleues vivantes (coloration nucléaire positive) et vertes apoptotiques (YOPRO-1 positive) dans ImageJ (NIH) pour au moins 5 îlots par souris (n = 3). Calculez le pourcentage de cellules d’îlots pancréatiques apoptotiques comme suit :
   Pourcentage de cellules d’îlots pancréatiques apoptotiques = Nombre de cellules apoptotiques / (nombre de cellules apoptotiques + nombre de cellules vivantes) x 100 %

5. Mesure de l’apoptose avec l’annexine V/ coloration nucléaire

1. Ajouter 2 gouttes de colorant nucléaire (40 μL) à 1 mL de tampon de liaison Annexin. Aliquote 100 μL de la solution dans une boîte de Pétri à fond de verre de 7 mm non traitée par culture tissulaire.
2. 24 h après l’incubation avec des cytokines, rincer soigneusement en pipetant de haut en bas 3x au moins 6 îlots de chaque traitement dans le PBS en pipetant trois fois de haut en bas à l’aide de la micropipette de 10 μl. Transférez les îlots dans la boîte de Pétri à fond de verre avec la solution de coloration nucléaire et incuberez-les pendant 40 min à 37 °C dans l’obscurité (couvrez d’une feuille d’aluminium).
3. Après 25 min d’incubation, ajouter 5 μL de conjugué Annexine V Alexa Flour 488 dans chaque boîte de Pétri à fond de verre et poursuivre l’incubation. Le temps total d’incubation est de 40 min pour la coloration nucléaire et de 15 min pour l’Annexine V.
4. Après 40 min d’incubation, transférer les îlots dans un tampon d’imagerie BMHH frais (sans annexine V ni coloration nucléaire) dans une boîte de Pétri à fond de verre de 7 mm.
5. Prenez des images à l’aide de la microscopie à fluorescence avec un objectif d’immersion dans l’eau 40x. Utilisez des lasers d’excitation à 405 nm et 488 nm pour détecter les émissions de fluorescence de la coloration nucléaire (460 nm) et du conjugué de l’annexine V (515 nm), respectivement.
6. Îlots d’images sous la forme d’une pile z composée de trois images, espacées de 10 μm. N’imagez que le 1/3 - 1/2 inférieur de l’îlot pour réduire la perte de signal due aux problèmes de diffusion de la lumière dans l’îlot.
7. Compter manuellement les cellules bleues vivantes (coloration nucléaire positive) et vertes apoptotiques (Annexine V-positive) dans ImageJ (NIH) pour au moins 5 îlots par souris (n = 3). Calculez le pourcentage de cellules d’îlots pancréatiques apoptotiques comme suit :
   Pourcentage de cellules apoptotiques = Nombre de cellules apoptotiques / (nombre de cellules apoptotiques + nombre de cellules vivantes) x 100 %

6. Mesure de la mort β-cellules à l’aide d’un indicateur sélectif Zn²⁺ / coloration nucléaire/PI

1. Ajouter 2 μL de solution mère d’indicateur sélectifAM de Zn²⁺ à 998 μL de tampon d’imagerie BMHH pour obtenir une concentration finale de 0,2 μM. Aliquote 500 μL de la solution de coloration dans une boîte de Pétri à fond de verre de 14 mm non traitée pour culture tissulaire.
2. 24 h après l’incubation avec des cytokines, transférez soigneusement au moins 6 îlots de chaque traitement dans la boîte de Pétri à fond de verre. Incuber pendant 1 h à 37 °C dans l’obscurité avec la solution AM d’indicateur sélectif Zn²⁺ (couvrir d’une feuille d’aluminium).
3. Après 20 min d’incubation, ajoutez une goutte de colorant nucléaire (20 μl) dans chaque boîte de Pétri à fond de verre, selon les instructions du fabricant, et poursuivez l’incubation. Le temps total d’incubation est de 1 h pour l’indicateur sélectif Zn²⁺ et de 40 min pour la coloration nucléaire.
4. Après 1 h d’incubation, transférer les îlots dans un tampon d’imagerie BMHH frais contenant 0,1 % de BSA (100 μL) dans une boîte de Pétri à fond de verre de 7 mm non traitée par culture tissulaire. Ajouter 2 μL de solution mère d’IP pendant 10 min pour obtenir une concentration finale de 20 μg/mL.
5. Prenez des images dans les 15 minutes suivant la coloration PI à l’aide de la microscopie à fluorescence avec un objectif d’immersion dans l’eau 40x. Utilisez des lasers d’excitation à 405 nm, 488 nm et 514 nm pour détecter les émissions de fluorescence de la coloration nucléaire (460 nm), de l’indicateur sélectif Zn²⁺ (516 nm) et de l’IP (620 nm), respectivement.
6. Îlots d’images sous la forme d’une pile z composée de trois images, espacées de 10 μm. N’imagez que le 1/3 - 1/2 inférieur de l’îlot pour réduire la perte de signal due aux problèmes de diffusion de la lumière dans l’îlot.
7. Comptez manuellement les cellules bleues vivantes (coloration nucléaire positive), vert zinc (indicateur sélectif Zn²⁺ positif) et rouge mort (PI positif) dans ImageJ (NIH) pour au moins 5 îlots par souris (n = 3). Calculez le pourcentage de mort à cellules β comme suit :
   pourcentage de mort des cellules β = nombre de cellules positives au zinc et PI positives / (nombre de cellules mortes + îlots de Langerhans vivantes) x 100 %
   ou
   pourcentage de mort β cellules = nombre de cellules positives au zinc et PI positives / (nombre de cellules positives au zinc) x 100 %

Résultats

La double coloration avec FDA et PI a été utilisée pour évaluer la viabilité des îlots traités avec des cytokines. Toutes les expériences ont été menées en trois exemplaires (n = 3), et les données ont été générées à partir de plusieurs images de la pile z espacées de 10 μm, chaque répétition contenant des données moyennes de 5 ou 6 îlots, afin d’assurer la reproductibilité et la comparaison statistique entre les îlots traités et non traités.

Discussion

Cette étude démontre l’efficacité des méthodes de multicoloration avec des colorants fluorescents et la microscopie confocale pour évaluer la viabilité des cellules des îlots pancréatiques, l’apoptose et la survie des cellules β sous stress induit par les cytokines. La coloration FDA/PI a révélé une augmentation dose-dépendante de la mort cellulaire dans les îlots exposés aux cytokines, comme en témoigne la fluorescence rouge marquant les cellules compromises par la m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mm glass-bottom Petri dish	Mattek	P35G-1.5-14-C
1640 RPMI	Corning	10-041-CV
35 mm Petri dish	Celltreat	229638
7 mm glass-bottom Petri dish	Mattek	P35G-1.5-7-C
Annexin V, Alexa Flour 488	Thermo Fisher (Invitrogen)	A13201	ex488/em515
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher	C79
Dimethyl Sulfoxide Anhydrous	Sigma	276855
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher (Gibco)	26140079
Flouzin-3, AM	Thermo Fisher (Invitrogen)	F24195	ex488/em516
Fluorescein Diacetate (FDA)	Thermo Fisher (Invitrogen)	F1303	ex488/em520
HEPES	Sigma	54457
Image processing software	NIH	ImageJ
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Thermo Fisher (Invitrogen)	R37605	ex360/em460
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher (Gibco)	15-140-122
Phosphate-buffered Saline Tablets	Fisher	BP2944-100
Potassium Chloride, Granular	Macron	6858-04
Propidium iodide	Thermo Fisher (Invitrogen)	P1304MP	ex535/em620
Protein Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI-100/CF
Recombinant Mouse IL-1 beta/IL-1F2	R&D Systems	401-ML-100/CF
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein	R&D Systems	410-MT-100/CF
Sodium Chloride, Crystal	Macron	7581-12
Stellaris Confocal microcope with spectral detectors	Leica	DMI-8	40x water immersion objective.
Yopro-1 Iodide	Thermo Fisher (Invitrogen)	Y3603	ex488/em509