Tratamento de ilhotas pancreáticas isoladas e medição de apoptose

Resumo

Este estudo utiliza marcadores de morte celular e apoptose baseados em fluorescência multicoloração combinados com microscopia confocal para avaliar a apoptose induzida por citocinas e a morte específica de β células em ilhotas pancreáticas. Revela mudanças espaciais e temporais na morte celular e apoptose em resposta a estímulos extracelulares.

Resumo

Este estudo investiga o efeito de citocinas pró-inflamatórias em ilhotas pancreáticas, particularmente células β produtoras de insulina, usando uma combinação de técnicas de coloração de fluorescência e microscopia confocal para avaliar a viabilidade celular, apoptose e morte específica de β células. Ilhotas isoladas de camundongos foram tratadas com concentrações variadas de um coquetel de citocinas, incluindo TNF-α, IL-1β e IFN-γ, para imitar a apoptose imunomediada durante o desenvolvimento de diabetes tipo 1. A viabilidade das células das ilhotas foi avaliada com coloração dupla FDA / PI, onde a conversão da FDA em fluoresceína indicou células viáveis e células comprometidas por membrana marcadas com PI. O YOPRO-1 e a coloração nuclear forneceram dados adicionais sobre a apoptose, com a Anexina-V confirmando as células apoptóticas precoces. A análise quantitativa revelou aumentos significativos nas taxas de apoptose e morte celular em ilhotas tratadas com citocinas. Para avaliar especificamente os efeitos nas células β, a coloração seletiva do indicador Zn²⁺ foi usada para rotular células produtoras de insulina por meio da associação de zinco em grânulos de insulina, revelando perda substancial de células β após o tratamento de ilhotas com citocinas pró-inflamatórias por 24 h. Esses protocolos de coloração múltipla capturam e quantificam efetivamente a extensão do dano induzido por citocinas nas ilhotas e podem ser usados para avaliar terapias projetadas para prevenir a apoptose de β células no diabetes tipo 1 inicial.

Introdução

As ilhotas pancreáticas, também conhecidas como ilhotas de Langerhans, são uma coleção de células endócrinas localizadas dentro do pâncreas. As células β produtoras de insulina são o componente mais abundante e funcionalmente significativo das ilhotas pancreáticas. Essas células β secretam insulina, um hormônio que desempenha um papel crítico na manutenção da homeostase da glicose¹. No diabetes tipo 1 (DM1), o sistema imunológico tem como alvo e se infiltra nas ilhotas pancreáticas, destruindo as células β produtoras de insulina. Esse ataque autoimune é mediado principalmente por citocinas pró-inflamatórias, incluindo interleucina-1β (IL-1β), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interferon-gama (IFN-γ)². Essas citocinas iniciam uma cascata de eventos de sinalização dentro das células β que, em última análise, desencadeiam a apoptose³. A apoptose, a morte celular programada, é um processo rigidamente regulado que envolve a ativação de caspases, fragmentação do DNA e desintegração celular. Contribui para a perda gradual da massa e função de β células durante o início do DM1³.

Compreender os mecanismos moleculares que impulsionam a apoptose de β células é fundamental para identificar estratégias para prevenir ou mitigar a destruição de β células no DM1. Para conseguir isso, ilhotas pancreáticas isoladas de modelos experimentais ou cadáveres humanos servem como um sistema modelo robusto e bem estabelecido para estudar a patologia de células ^{β 2,3}. Ao tratar essas ilhotas isoladas com citocinas pró-inflamatórias, os pesquisadores podem replicar o ambiente que caracteriza o DM1 precoce, permitindo o estudo detalhado da disfunção e morte de β células in vitro ^4,5. Esses experimentos fornecem informações importantes sobre a vulnerabilidade e a sobrevivência das células β em condições associadas à doença e também servem como uma plataforma para testar intervenções terapêuticas destinadas a proteger ou resgatar células β da apoptose induzida por citocinas. Ao utilizar este sistema in vitro, podemos efetivamente analisar como ilhotas de diferentes espécies respondem a várias condições, proporcionando uma melhor compreensão das variações funcionais e apoptóticas entre as espécies.

Estudos anteriores mostraram que ilhotas de camundongos e humanos tratadas por 24 h com um coquetel (1x = 10 ng/mL de TNF-α, 5 ng/mL de IL-1β e 100 ng/mL de IFN-γ) de citocinas de camundongos e derivadas de humanos, respectivamente, resultaram em morte significativa de células das ilhotas ^4,5,6. A viabilidade das ilhotas foi confirmada pela coloração das células tratadas com citocinas com diacetato de fluoresceína (FDA) e iodeto de propídio (PI)^5,6. Globalmente, a viabilidade das ilhotas é avaliada usando a técnica padrão de exclusão de corante de ligação ao ácido desoxirribonucléico (DNA) com FDA e PI⁷. Corantes fluorescentes ou substratos conjugados com corante avaliam a viabilidade celular com base na integridade e permeabilidade da membrana. O FDA, um corante permeável às células, é convertido por células vivas em fluorescência verde (fluoresceína). Em contraste, o PI, um corante impermeável às células, cora apenas os núcleos das células mortas com membranas comprometidas⁷. As células são então analisadas por meio de imagens de duas cores em um microscópio confocal, onde as fluorescentes verdes e vermelhas marcam células viáveis e mortas, respectivamente.

A limitação do protocolo de coloração FDA/PI é que o IP só entra nas células que perderam a seletividade da membrana, o que significa que não pode distinguir células apoptóticas precoces. Além disso, este método não pode diferenciar entre subconjuntos de células, tornando-o inadequado para avaliar seletivamente a viabilidade de β células. O protocolo Anexina V/PI é comumente utilizado para o estudo de células apoptóticas, e o protocolo foi modificado para melhorar sua^acurácia8. Os estágios iniciais da apoptose envolvem a translocação da fosfatidilserina da camada interna para a externa da membrana plasmática. A anexina V, uma proteína dependente de cálcio, liga-se com alta afinidade a essa fosfatidilserina exposta. A coloração com IP é realizada juntamente com a anexina-V para distinguir as células apoptóticas (apenas anexina V-positiva) das células necróticas (positivas para anexina-V e IP), pois as células necróticas também exibem fosfatidilserina devido ao comprometimento da integridade da membrana⁹. Outros corantes, como o YOPRO-1, também são usados para quantificar a apoptose das células das ilhotas. A membrana celular das células viáveis é impermeável ao YOPRO-1, ao contrário da anexina-V, que não pode quantificar células vivas submetidas à apoptose.

Para avaliar a morte de células β pancreáticas, são necessários corantes específicos direcionados apenas às células produtoras de insulina. Uma característica distinta das células β pancreáticas é que uma porção de Zn²⁺ intracelular é armazenada nas vesículas como um complexo Zn²⁺-insulina (proporção de 2:1)¹⁰. O Zn livre²⁺ também existe no espaço extragranular ao redor das células β como reservatórios. Zn²⁺ e Zn²⁺ livres fracamente ligados à insulina em grânulos secretores podem ser visualizados usando corantes de ligação ao zinco. A ditizona, um corante de ligação ao zinco, é comumente usada para avaliar a pureza das ilhotas, mas não pode ser combinada com corantes fluorescentes usados para avaliar a viabilidade e a função das células β¹¹. Sondas UV como TSQ e Zinquin, que são altamente seletivas em relação ao Zn²⁺, foram desenvolvidas para quantificar as células β por imagem e medição de Zn²⁺ intracelular livre^{; 12,13}. No entanto, seu uso é limitado pela baixa solubilidade, carga celular desigual, necessidade de excitação UV e compartimentalização em vesículas ácidas¹⁴. Sondas fluorescentes de comprimento de onda visível, como o indicador seletivo Newport green e Zn²⁺, também foram desenvolvidas para superar essas limitações e agora são amplamente utilizadas para detectar células β em ilhotas humanas isoladas^15,16. O FluoZin-3 (indicador seletivo de Zn²⁺) tem maior afinidade de Zn²⁺ e rendimento quântico superior do que Newport Green e provou ser eficaz para imagens de Zn²⁺ co-liberadas com insulina em ilhotas isoladas^14,17.

O uso de corantes fluorescentes como FDA, PI, Anexina V, YOPRO-1 e indicador seletivo Zn²⁺ permite a medição e diferenciação entre células mortas viáveis, apoptóticas e totais. A combinação de sondas compatíveis e altamente seletivas também oferece um método direcionado para avaliar e quantificar a viabilidade e a apoptose de β células, o que é fundamental para entender e mitigar a destruição de células β na pesquisa e no desenvolvimento de medicamentos para diabetes.

Protocolo

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado em Denver (Protocolos 000929). Os camundongos C57Bl / 6 usados para este experimento foram comprados do Laboratório Jackson e alojados em uma instalação com temperatura controlada em um ciclo claro/escuro de 12 h com acesso a comida e água ad libitum. As ilhotas isoladas de camundongos foram obtidas usando o protocolo de digestão da colagenase, que foi descrito anteriormente ^5,18.

1. Preparação de soluções e meios de cultura

NOTA: Meios de cultura, estoques de citocinas e outros reagentes devem ser preparados em condições estéreis.

1. Prepare um meio de cultura de ilhotas adicionando 10% de soro fetal bovino (FBS), 10.000 U / mL de penicilina e 10.000 μg / mL de estreptomicina a 500 mL de meio 1640 RPMI.
2. Prepare 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4. Prepare uma solução-mãe 1000x de coquetel de citocinas de camundongo, 10 μg/mL de TNF-α 10μg/mL, 5 μg/mL de IL-1β e 100 μg/mL de IFN-γ em PBS estéril contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e armazene a solução em alíquotas de 10 μL a -20 °C.
3. Prepare uma solução estoque FDA 46 μM (50x) em acetona e armazene-a em alíquotas de 1 mL a -20 ° C. Preparar uma solução de reserva de PI a 1,434 mM (50x) em PBS e armazená-la em alíquotas de 1 ml a 4 °C.
4. Prepare 500 mL de tampão Krebs-Henseleit HEPES modificado com bicarbonato (BMHH) com 125 mM de NaCl, 5,7 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de MgCl₂ e 10 mM de HEPES em 500 mL de dH₂O. Ajuste o pH para 7,4.
5. Prepare 100 mL de tampão de ligação Annexin-V com 10 mM HEPES, 140 mM NaCl e 2,5 mM CaCl₂ em 100 mL de dH₂O. Ajuste o pH para 7,4.
6. Preparar a solução de reserva selectiva do indicador^{1mM Zn 2+} em DMSO e conservar em alíquotas de 10 μL a -20 °C.
   NOTA: Os corantes fluorescentes são sensíveis à luz, portanto, o armazenamento e a incubação devem ser no escuro.

2. Tratamento de ilhotas isoladas com citocinas

1. Isolar as ilhotas de camundongos com uma micropipeta de 10 μL no meio de cultura e incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO₂ para se recuperar do estresse de isolamento antes do tratamento com citocinas.
2. Adicione 2 mL do meio de cultura de ilhotas esterilizado a placas de Petri não tratadas com cultura de tecidos de 35 mm e rotule-as adequadamente para diferenciar placas tratadas com citocinas e não tratadas sem citocinas.
3. Para placas tratadas com citocinas, remova 6 μL de meio de cultura e substitua-o por 2 μL de cada citocina da solução estoque para obter uma concentração relativa final de citocinas de 10 ng / mL, 5 ng / mL IL-1β e 100 ng / mL IFN-γ (1x CCR).
   NOTA: O CCR mais baixo de 0,5x e 0,1x pode ser preparado diluindo as soluções de estoque com PBS estéril contendo 0,1% de BSA a 1:1 e 1:9, respectivamente.
4. Às 12 h-24 h após o isolamento, pegue 10-20 ilhotas usando uma micropipeta sob um microscópio óptico e transfira para os pratos e incube em uma incubadora umidificada a 37 ° C, 5% de CO₂ por 24 h.
   NOTA: O tempo de incubação pode variar dependendo dos objetivos experimentais específicos.

3. Medição da viabilidade das ilhotas com FDA/PI

1. Adicione 20 μL de cada uma das soluções estoque FDA e PI a 960 μL do tampão BMHH contendo 0,1% de BSA para obter uma concentração final de 0,46 μM e 14,34 μM dos corantes fluorescentes, respectivamente.
2. Alíquota de 100 μl da solução de coloração para uma placa de Petri de 7 mm, não tratada com cultura de tecidos, com fundo de vidro.
3. Às 24 h após a incubação com citocinas, transferir cuidadosamente pelo menos 6 ilhotas de cada tratamento para a placa de Petri com fundo de vidro. Incube por 5 a 10 min em temperatura ambiente no escuro (cubra com papel alumínio).
4. Tire imagens usando microscopia de fluorescência com uma objetiva de imersão em água de 40x. Tire imagens dentro de 15 minutos após a coloração FDA/PI.
5. Use lasers de excitação a 488 nm e 514 nm para detectar as emissões de fluorescência para FDA (520 nm) e PI (620 nm), respectivamente.
6. Ilhotas de imagem como uma pilha z consistindo de três imagens, separadas por 10 μm. Visualize apenas o 1/3 - 1/2 inferior da ilhota para reduzir a perda de sinal devido a problemas de dispersão de luz na ilhota.
7. Conte células verdes vivas (positivas para FDA) e vermelhas mortas (positivas para PI) manualmente no ImageJ (NIH) para pelo menos 5 ilhotas por camundongo (n = 3). Calcule a porcentagem de morte celular da seguinte forma:
   Porcentagem de morte de ilhotas = número de células mortas/ (número de células mortas + número de células vivas) x 100%

4. Medição da apoptose por coloração

1. Adicione 8 μL de YOPRO-1 (solução de 1mM) a 992 μL de tampão de imagem BMHH para uma concentração final de 0,8 μM.
2. Alíquota de 500 μl da solução de coloração para uma placa de Petri de 14 mm, não tratada com cultura de tecidos, com fundo de vidro.
3. Às 24 h após a incubação com citocinas, transferir cuidadosamente pelo menos 6 ilhotas de cada tratamento para a placa de Petri com fundo de vidro e incubar durante 1 h a 37 °C no escuro (cobrir com papel alumínio).
4. Após 20 minutos de incubação, adicione uma gota de NucBlue (corante nuclear, 20 μL) a cada placa de Petri com fundo de vidro e continue a incubação. O tempo total de incubação é de 1 h para YOPRO-1 e 40 min para coloração nuclear.
5. Após 1 h de incubação, transfira as ilhotas para um tampão de imagem BMHH fresco contendo 0,1% de BSA (100 μL) em uma placa de Petri não tratada com cultura de tecidos com fundo de vidro de 7 mm.
6. Tire imagens usando microscopia de fluorescência com uma objetiva de imersão em água de 40x. Use lasers de excitação a 405 nm e 488 nm para detectar as emissões de fluorescência da coloração nuclear (460 nm) e YOPRO-1 (509 nm), respectivamente.
7. Ilhotas de imagem como uma pilha z consistindo de três imagens, separadas por 10 μm. Visualize apenas o 1/3 - 1/2 inferior da ilhota para reduzir a perda de sinal devido a problemas de dispersão de luz na ilhota.
8. Conte células vivas azuis (positivas para coloração nuclear) e verdes apoptóticas (positivas para YOPRO-1) manualmente em ImageJ (NIH) para pelo menos 5 ilhotas por camundongo (n = 3). Calcule a porcentagem de células das ilhotas apoptóticas da seguinte forma:
   porcentagem de células das ilhotas apoptóticas = número de células apoptóticas / (número de células apoptóticas + número de células vivas) x 100%

5. Medição da apoptose com anexina V / coloração nuclear

1. Adicione 2 gotas de corante nuclear (40 μL) a 1 mL de tampão de ligação de anexina. Alíquota de 100 μl da solução para uma placa de Petri não tratada com cultura de tecidos com fundo de vidro de 7 mm.
2. Às 24 h após a incubação com citocinas, enxágue cuidadosamente pipetando para cima e para baixo 3x pelo menos 6 ilhotas de cada tratamento em PBS, pipetando para cima e para baixo três vezes usando a micropipeta de 10 μl. Transferir os ilhéus para a placa de Petri com fundo de vidro com a solução de corante nuclear e incubá-los durante 40 min a 37 °C no escuro (cobrir com papel alumínio).
3. Após 25 min de incubação, adicione 5 μL de Anexina V Alexa Flour 488 conjugado a cada placa de Petri com fundo de vidro e continue a incubação. O tempo total de incubação é de 40 min para a coloração nuclear e 15 min para a Anexina V.
4. Após 40 min de incubação, transfira as ilhotas para um tampão de imagem BMHH fresco (sem anexina V ou coloração nuclear) em uma placa de Petri com fundo de vidro de 7 mm.
5. Tire imagens usando microscopia de fluorescência com uma objetiva de imersão em água de 40x. Use lasers de excitação a 405 nm e 488 nm para detectar as emissões de fluorescência da coloração nuclear (460 nm) e do conjugado de Anexina V (515 nm), respectivamente.
6. Ilhotas de imagem como uma pilha z consistindo de três imagens, separadas por 10 μm. Visualize apenas o 1/3 - 1/2 inferior da ilhota para reduzir a perda de sinal devido a problemas de dispersão de luz na ilhota.
7. Conte células vivas azuis (positivas para coloração nuclear) e verdes apoptóticas (positivas para anexina V) manualmente em ImageJ (NIH) para pelo menos 5 ilhotas por camundongo (n = 3). Calcule a porcentagem de células das ilhotas apoptóticas da seguinte forma:
   porcentagem de células apoptóticas = número de células apoptóticas / (número de células apoptóticas + número de células vivas) x 100%

6. Medição da morte de células β usando indicador seletivo de Zn²⁺ / coloração nuclear / PI

1. Adicionar 2 μL de solução estoque seletiva de Zn²⁺ indicator AM a 998 μL de tampão de imagem BMHH para fazer uma concentração final de 0,2 μM. Alíquota de 500 μL da solução de coloração em uma placa de Petri de 14 mm com fundo de vidro não tratada com cultura de tecidos.
2. Às 24 h após a incubação com citocinas, transferir cuidadosamente pelo menos 6 ilhotas de cada tratamento para a placa de Petri com fundo de vidro. Incubar durante 1 h a 37 °C no escuro com a solução AM de indicador selectivo de Zn²⁺ (cobrir com folha de alumínio).
3. Após 20 minutos de incubação, adicione uma gota de corante nuclear (20 μl) a cada placa de Petri com fundo de vidro, de acordo com as instruções do fabricante e continue a incubação. O tempo total de incubação é de 1 h para o indicador seletivo de Zn²⁺ e 40 min para a coloração nuclear.
4. Após 1 h de incubação, transfira as ilhotas para um tampão de imagem BMHH fresco contendo 0,1% de BSA (100 μL) em uma placa de Petri não tratada com cultura de tecidos com fundo de vidro de 7 mm. Adicione 2 μL de solução estoque de PI por 10 min para fazer uma concentração final de 20 μg/mL.
5. Tire imagens dentro de 15 minutos após a coloração PI usando microscopia de fluorescência com uma objetiva de imersão em água de 40x. Use lasers de excitação a 405 nm, 488 nm e 514 nm para detectar as emissões de fluorescência da coloração nuclear (460 nm), indicador seletivo de Zn²⁺ (516 nm) e PI (620 nm), respectivamente.
6. Ilhotas de imagem como uma pilha z consistindo de três imagens, separadas por 10 μm. Visualize apenas o 1/3 - 1/2 inferior da ilhota para reduzir a perda de sinal devido a problemas de dispersão de luz na ilhota.
7. Conte células vivas azuis (positivas para coloração nuclear), verde zinco (indicador seletivo positivo de Zn²⁺ ) e vermelho morto (PI-positivo) manualmente em ImageJ (NIH) para pelo menos 5 ilhotas por camundongo (n = 3). Calcule a porcentagem de morte de β células da seguinte forma:
   porcentagem de morte de β células = número de células positivas para zinco e positivas para IP / (número de células mortas + ilhotas vivas) x 100%
   ou
   porcentagem de morte de β células = número de células positivas para zinco e positivas para PI / (número de células positivas para zinco) x 100%

Resultados

A coloração dupla com FDA e PI foi utilizada para avaliar a viabilidade de ilhotas tratadas com citocinas. Todos os experimentos foram conduzidos em triplicata (n = 3), e os dados foram gerados a partir de várias imagens z-stack de 10 μm de distância, com cada réplica contendo dados médios de 5 ou 6 ilhotas, para garantir a reprodutibilidade e comparação estatística entre as ilhotas tratadas e não tratadas. A Figura 1A mostra ilhotas saudáveis do...

Discussão

Este estudo demonstra a eficácia dos métodos de multicoloração com corantes fluorescentes e microscopia confocal na avaliação da viabilidade das células das ilhotas, apoptose e sobrevivência de β células sob estresse induzido por citocinas. A coloração FDA / PI revelou um aumento dependente da dose na morte celular dentro das ilhotas expostas a citocinas, como evidenciado pela fluorescência vermelha marcando células comprometidas pela membrana, confirmando o efeito citotóx...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mm glass-bottom Petri dish	Mattek	P35G-1.5-14-C
1640 RPMI	Corning	10-041-CV
35 mm Petri dish	Celltreat	229638
7 mm glass-bottom Petri dish	Mattek	P35G-1.5-7-C
Annexin V, Alexa Flour 488	Thermo Fisher (Invitrogen)	A13201	ex488/em515
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher	C79
Dimethyl Sulfoxide Anhydrous	Sigma	276855
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher (Gibco)	26140079
Flouzin-3, AM	Thermo Fisher (Invitrogen)	F24195	ex488/em516
Fluorescein Diacetate (FDA)	Thermo Fisher (Invitrogen)	F1303	ex488/em520
HEPES	Sigma	54457
Image processing software	NIH	ImageJ
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Thermo Fisher (Invitrogen)	R37605	ex360/em460
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher (Gibco)	15-140-122
Phosphate-buffered Saline Tablets	Fisher	BP2944-100
Potassium Chloride, Granular	Macron	6858-04
Propidium iodide	Thermo Fisher (Invitrogen)	P1304MP	ex535/em620
Protein Recombinant Mouse IFN-gamma Protein	R&D Systems	485-MI-100/CF
Recombinant Mouse IL-1 beta/IL-1F2	R&D Systems	401-ML-100/CF
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein	R&D Systems	410-MT-100/CF
Sodium Chloride, Crystal	Macron	7581-12
Stellaris Confocal microcope with spectral detectors	Leica	DMI-8	40x water immersion objective.
Yopro-1 Iodide	Thermo Fisher (Invitrogen)	Y3603	ex488/em509