通过细胞分选分离含肺类视黄醇的细胞

摘要

下面描述的方案是一种简单有效的方法，通过利用特异性类视黄醇自发荧光和采用荧光激活细胞分选，从高度异质的肺细胞群中分离含维甲酸的细胞。

摘要

类维生素 A（维生素 A 及其代谢物）是肺泡微环境的重要组成部分，需要细胞类型特异性类维生素 A 代谢来维持发育中和成人肺的功能健康。肺细胞利用特定途径，允许从血液中有效吸收循环类视黄醇 （ROH），然后在细胞内逐步将 ROH 转化为转录活性的类视黄酸物种，全反式维甲酸 （ATRA）。ATRA 介导的（或类维生素 A 介导的）信号转导对于调节肺泡形成、表面活性剂产生、血管生成、通透性和免疫至关重要。重要的是，特定的肺细胞，包括成纤维细胞，可以以视黄酯 （RE） 的形式积累类视黄醇，这些类视黄醇可以储存或进一步动员为 ROH，以便在需要时转移到邻近细胞。通过利用类视黄醇自发荧光（在 350 nm 激发时在 455 nm 处发射）和采用荧光激活细胞分选 （FACS），可以从消化肺的单细胞悬液中分离和收集含肺类视黄醇的肺细胞。用红色荧光蛋白对肺细胞进行额外的细胞特异性 体内 标记，可以分离和收集含有特异性类视黄醇的肺细胞群。收集的细胞可以直接分析或培养，以进一步分析细胞形态、基因表达和对药理学作的反应性。这种分离和应用技术对于肺部健康和肺损伤的动物模型研究非常重要，可以更深入地了解肺部类维生素 A 代谢的细胞方面和脂质介导的细胞通讯。

引言

类维生素 A（维生素 A 及其代谢物）是肺泡微环境的重要组成部分，需要细胞类型特异性类视黄醇代谢和信号传导来维持发育中和成人肺的功能健康 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ^，12,13,14。肺细胞利用特定途径，允许从血液中有效吸收循环饮食衍生的类视黄醇作为视黄醇 （ROH）15,16,17,18,19，然后在细胞内逐步将 ROH 转化为转录活性的类视黄酸物种，全反式维甲酸 （ATRA）²⁰.ATRA 介导的（或类视黄醇介导的）信号转导是通过 ATRA 与其三种不同的同源核激素受体、视黄酸受体（RARα、RARβ 和 RARγ ^21,22）相互作用实现的，并且对调节肺泡形成至关重要 23,24,25,26,27,28,29，表面活性剂的产生^30，31,32,33,34,35，血管生成³⁶，通透性³⁷ 和免疫 38,39,40。重要的是，特定的肺细胞，尤其是肺成纤维细胞，可以以视黄酯 （RE） 的形式积累类视黄醇，这些类视黄醇可以储存或进一步动员为 ROH，以便在需要时转移到邻近细胞¹。

类维生素 A 代谢和信号传导的复杂性，以及肺的细胞复杂性，使得旨在 探索体内肺部 类维生素 A 代谢的研究具有挑战性。我们概述了一种简单而强大的方案，用于通过利用特异性类视黄醇自发荧光（在 350 nm 激发时在 455 nm 处发射）和采用荧光激活细胞分选 （FACS） 从高度异质的肺细胞群中分离含维甲酸的细胞（图 1）。如果研究的目标是根据原代活肺细胞储存类维生素 A 的能力分离和表征原代活肺细胞，则该方案不需要额外的细胞标记，但活力染色除外。这显著缩短了细胞分选的准备时间，无需额外染色，并允许分离高产量的活原代细胞。但是，如果研究的目标是分离和表征特定的肺细胞群（成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞或免疫细胞），则可以在用细胞特异性抗体标记分选的含维甲酸的细胞后进行额外的细胞分选。

类视黄醇自发荧光已在已发表的研究中用于确定含类视黄醇细胞的身份和/或量化这些细胞在肝脏 41,42,43,44、胰腺^45,46、肾脏^41,47 和肺⁴¹ 中的丰度.此外，几个研究小组报告了使用类视黄醇荧光通过 FACS 分离并研究活组织中含维甲酸的原代含维甲酸的细胞，包括肝脏^{44、48、49、50、51、52、53} 和肺¹。在当前的方案中，我们展示了如何在使用 tdTomato（红色荧光蛋白）分离含有类视黄醇的细胞之前在体内标记特定细胞群。tdTomato 的光谱特性（在 554 nm 激发时在 581 nm 处的发射⁵⁴）和亮度不会干扰类视黄醇自发荧光，因此可以方便地在分选过程中实现细胞特异性。鉴于未受损的类视黄醇代谢和信号传导在正常肺泡微环境中的关键作用¹，所描述的肺细胞分离技术是肺部健康和疾病动物模型研究的有用工具，可以更深入地了解肺部类视黄醇代谢的细胞方面和脂质介导的体内细胞通讯。

研究方案

所有涉及小鼠的描述程序和实验均经罗格斯大学机构动物护理和使用委员会 （IACU PROTO202200111 C） （IACUC） 批准进行，根据美国国家科学院⁵⁵ 编写的实验动物护理和使用指南中概述的标准。

1. 实验的注意事项和准备

1. 畜牧业和作
   注意：三个月大（10-12 周龄）雄性和雌性小鼠可用于研究。在所述实验中使用了 C57BL/6J 遗传背景上的卵磷脂：视黄醇酰基转移酶缺陷小鼠 （Lrat-缺陷， Lrat^-/- 小鼠⁵⁶） 和年龄匹配的同窝小鼠 （野生型， Lrat^+/+ 小鼠）。在成纤维细胞（F-tdT 小鼠）中表达 tdTomato 基因的小鼠是通过杂交携带 tdTomato 报告盒 （B6.Cg-Gt（ROSA）26Sor^{tm14（CAG-tdTomato）Hze}/J，Jackson Lab 菌株 #007914） 与 Col1a2-CreER 小鼠 （B6.Cg-Tg（Col1a2-Cre/ERT，-ALPP）7Cpd/2J，Jackson 实验室菌株 #029567）。
   1. 采用表达 Cre 的小鼠模型，这是在 体内标记目标细胞群的众多可用选项之一。
      注意：根据靶细胞的选择、Cre 表达、Cre 介导的重组效率和细胞特异性，研究人员可以使用任何可靠的 Cre 表达小鼠模型。
   2. 使用 tdTomato 转基因表达（如下所述他莫昔芬处理后）标记 Col1a2 ⁺ 成纤维细胞，然后如下所述从消化肺的单细胞悬液中分离它们。
2. Cre 介导的体内重组和转基因激活
   1. 通过腹膜内 （IP） 注射 2 mg 他莫昔芬，每 24 小时一次，共连续 5 天，诱导 F-tdT 小鼠的 Cre 表达。
   2. 注射前用 70% 乙醇对注射部位进行消毒。在最后一次他莫昔芬注射后 1 个月使用小鼠进行实验。
   3. 在分选实验之前检查 Cre 重组的有效性。通过使用抗 Pdgfrα 磁珠和磁激活细胞分选 （MACS） 从他莫昔芬处理的 F-tdT 小鼠中分离肺成纤维细胞的靶细胞群，确认有效的 Cre 重组和 tdTomato 表达。
3. 制备塑料和玻璃器皿的溶液
   注意：对于下述程序，应遵循无菌技术。涉及溶液制备、组织消化和细胞分离的程序应在层流罩下进行。溶液应使用 0.2 μm 过滤器过滤进行消毒;手术工具和实验室器具应通过高压灭菌进行消毒。
   1. 在层流罩下，准备不含钙和镁的汉克斯平衡盐溶液 （HBSS）（不含 Ca²⁺/Mg²⁺的 HBSS，含有 5.3 mM KCl、0.4 mM KH₂PO₄、4.2 mM NaHCO₃、137.9 mM NaCl、0.3 mM Na₂HPO₄、5.6 mM D-葡萄糖）用于肺灌注（每只小鼠 5 mL）。使用 0.2 μm 过滤器对溶液进行消毒，并用溶液填充注射器。
   2. 在层流罩下，用钙和镁（含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 HBSS，含 1.3 mM CaCl₂、0.5 MgCl_2·6H₂O，0.4 mM 硫酸镁_4·7H₂O、5.3 mM KCl、0.4 mM KH₂PO₄、4.2 mM NaHCO₃、137.9 mM NaCl、0.3 mM Na₂HPO₄、5.6 mM D-葡萄糖），含有 0.3 mg/mL 的 IV 型胶原酶和 1 mg/mL 用于肺灌注的分散酶（每只小鼠 10 mL）。使用 0.2 μm 过滤器对溶液进行消毒，并用溶液填充注射器。
   3. 在层流罩下，用 Ca²⁺/Mg²⁺ 制备 HBSS，含有 0.3 mg/mL 的 IV 型胶原酶、1 mg/mL 的分散酶和 5 mg/mL 的 DNase I，用于肺消化（每只小鼠 10 mL）。使用 0.2 μm 过滤器对溶液进行消毒，并用溶液填充注射器。
   4. 在层流罩下，用 2 mL 含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的无菌 HBSS 填充细胞培养皿（35 mm 10 mm，每个从一只小鼠收集的肺一个培养皿）。将含有 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 HBSS 的培养皿放在冰上。

2. 单细胞悬液的肺灌注、消化和收集

1. 通过 IP 注射以 0.01 mL/g 体重的剂量施用含有 10 mg/mL 氯胺酮和 2 mg/mL 甲苯噻嗪的麻醉混合物来麻醉小鼠。
2. 通过评估脚趾捏合反应，确保鼠标处于深度无意识状态。去除手术部位松散的毛发和可见的污垢/碎屑，用 70% 酒精夹住并擦拭手术部位进行消毒。
3. 使用无菌手术工具，打开腹腔和胸腔。切开肋骨和横膈膜，露出肺和心脏。
   注意：这将确保立即死亡，因为开胸手术会导致小鼠麻醉时呼吸停止;如果执行得当，这部分程序从手术开始到开胸手术，然后是动物死亡，最多需要 3 分钟。
4. 切开下腔静脉并应用吸收垫以吸收释放的血液。
5. 使用 10 mL 注射器通过心脏 右心室原位灌注肺部，注射器带有 25 G X 1“ 针头，其中装有 5 mL 不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的无菌 HBSS。如果灌注成功，肺组织会变成白色。
6. 使用 10 mL 注射器 原位 灌注肺部，注射器用 25 G X 1“ 针头灌注 10 mL 无菌 HBSS，含 Ca²⁺/Mg²⁺，含有 IV 型胶原酶 （0.3 mg/mL） 和分散酶 （1 mg/mL）。
7. 取出肺并将其转移到细胞培养皿 （35 mm X 10 mm） 中，其中含有 2 mL 含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的无菌 HBSS。
8. 在层流罩下，冲洗肺部并使用无菌手术刀片（#20，适合手柄 #4）将其切成小块。将前 5 mL 含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 HBSS （含有 0.3 mg/mL IV 型胶原酶、1 mg/mL 分散酶和 5 mg/mL DNase I）添加到切碎的组织中，并将切碎的肺转移到 15 mL 管中，并使用 10 mL 血清移液管转移。用含有 0.3 mg/mL IV 型胶原酶、1 mg/mL 分散酶和 5 mg/mL DNase I 的 Ca²⁺/Mg²⁺ 洗涤细胞培养皿，收集并转移剩余的切碎的组织残留物。
9. 将切碎的肺组织在含有 0.3 mg/mL IV 型胶原酶、1 mg/mL 分散酶和 5 mg/mL DNase I 的 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 HBSS 中在旋转振荡器上孵育，保持在 37 °C 45 分钟。在三个 15 分钟的间隔中，在层流罩下，将切碎的组织通过 10 mL 血清移液管 10 次，以更好地解离细胞。
10. 将所得细胞悬液通过 100 μm 过滤器，将单细胞收集到含有 20 mL 冷活细胞成像溶液（含 20 mM HEPES 的生理盐水，pH 7.4）且胎牛血清 （FBS） 含量低于 5% 的 50 mL 试管中。通过在 4 °C 下以 500 g 离心 10 分钟来收集细胞。
11. 吸出上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 红细胞裂解缓冲液中，并在室温 （RT） 下放置试管 5 分钟以消除红细胞。加入 20 mL 含 FBS 少于 5% 的冷活细胞成像溶液。通过在 4 °C 下以 500 g 离心 10 分钟来收集细胞。
12. 吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于 20 mL FBS 含量低于 5% 的冷活细胞成像溶液中。将所得细胞悬液通过 40 μm 过滤器，将单细胞收集到含有 20 mL 冷活细胞成像溶液（FBS 含量低于 5%）的 50 mL 试管中。通过在 4 °C 下以 500 g 离心 10 分钟来收集细胞。
13. 吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于 10 mL 含 FBS 少于 5% 的冷活细胞成像溶液中。对细胞进行计数，并将细胞浓度调节至 ~5-10 x 10⁶ 个细胞/mL。

3. 使用荧光激活细胞分选 （FACS） 分离含维A酸的肺细胞

1. 取等分试样的细胞悬液，放在一边用作未染色的门控对照。将活力染料 SYTOX Green 添加到剩余的细胞悬液中（1：1000 稀释，终浓度 30 nM）。
2. 使细胞悬液通过连接到聚苯乙烯 5 mL （12 x 75 mm） 收集管的过滤器。
3. 通过根据它们在 455 nm 处的发射对含有单个类视黄醇的活细胞进行分类，进行 FACS 细胞分离。使用前向散射图（前向散射高度/FSC-H 与前向散射区域/FSC-A）进行顺序单态鉴别。通过散射特性（侧向散射）和用 SYTOX Green 染色排除死细胞。
4. 在 350 nm 激发时，使用 455 nm 发射对单个活的含维甲酸的细胞进行门控、分选和收集。
   注意：使用所描述的程序，可以从一个小鼠肺中收集大约 5·10⁵ 个含维甲酸的肺细胞。
5. 使用流式细胞术软件进行 FACS 数据分析。

结果

分离含肺类维生素 A 的细胞
对小鼠肺（来自 Lrat ^{+ / +} 和 Lrat ^{- / -} ）小鼠进行酶消化，制备单细胞悬液并根据上述程序进行 FACS。在 Cytek Aurora™ 细胞分选仪系统上进行细胞分选和数据采集，该系统由 SpectroFlo CS 软件版本 1.3.0作，使用 100 μm 喷嘴和 15 psi 压力。首先，应用前向散射图（前向散射高...

讨论

早在 1940 年代，就首次报道了人类和动物组织中维生素 A 的检测能力及其使用荧光显微镜的组织学可视化^59,60。然后，类视黄醇自发荧光现象成功地应用于旨在定位体外组织中高浓度维生素 A ⁶¹ 和使用荧光显微镜表征动物胚胎组织形态发生⁶² 的研究。后来通过实验观察和证实，细胞类?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipette	Avantor/VWR	76452-284
100 µm strainer	Greiner Bio-One	542000
15 mL falcon tube	Corning	352099
40 µm strainer	Greiner Bio-One	542040
50 mL falcon tube	Corning	352070
Cell culture dish, 35 mm ´ 10 mm	Corning	430165
Cell sorting media	Gibco	A59688DJ
Collagenase type IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004188
Cytek Aurora Cell Sorter System	Cytek Biosciences
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
Falcon brand 5-ml polypropylene round bottom tube, 12 mm ´ 75 mm	Corning	352063
Falcon brand 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap, 12 mm ´ 75 mm	Corning	352235
FlowJo software	Becton Dickinson		flow cytometry software
HBSS with Ca2+/Mg2+	Gibco	14925-092
HBSS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-095
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters	ThermoFisher	595-3320
Red Cell lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
SpectroFlo CS software	Cytek Biosciences	Version 1.3.0
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades	Fisher Scientific	22-079-683
SYTOX Green dead cell stain	Invitrogen	S34860
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T2859