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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo descritto di seguito è un modo semplice ed efficace per isolare cellule contenenti retinoidi da popolazioni di cellule polmonari altamente eterogenee utilizzando l'autofluorescenza retinoide specifica e impiegando la selezione cellulare attivata da fluorescenza.

Abstract

I retinoidi (vitamina A e suoi metaboliti) sono un componente lipidico essenziale del microambiente alveolare e il metabolismo dei retinoidi specifico per tipo di cellula è necessario per mantenere la salute funzionale dei polmoni in via di sviluppo e adulti. Le cellule polmonari utilizzano percorsi specifici, che consentono l'assorbimento efficiente dei retinoidi circolanti dal sangue come retinolo (ROH), seguito dalla conversione intracellulare graduale di ROH nella specie retinoide trascrizionalmente attiva, l'acido all-trans-retinoico (ATRA). La segnalazione mediata da ATRA (o retinoide) è fondamentale per regolare l'alveolarizzazione polmonare, la produzione di tensioattivi, l'angiogenesi, la permeabilità e l'immunità. È importante sottolineare che specifiche cellule polmonari, compresi i fibroblasti, possono accumulare retinoidi sotto forma di esteri retinilici (RE), che possono essere immagazzinati o ulteriormente mobilizzati come ROH per il trasferimento alle cellule vicine quando necessario. Le cellule polmonari contenenti retinoidi possono essere isolate e raccolte dalla sospensione di una singola cellula dei polmoni digeriti utilizzando l'autofluorescenza dei retinoidi (l'emissione a 455 nm dopo eccitazione a 350 nm) e impiegando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Un'ulteriore marcatura in vivo cellulo-specifica delle cellule polmonari con proteina fluorescente rossa consente di isolare e raccogliere specifiche popolazioni di cellule polmonari contenenti retinoidi. Le cellule raccolte possono essere analizzate direttamente o coltivate per ulteriori analisi della morfologia cellulare, dell'espressione genica e della risposta alle manipolazioni farmacologiche. Questa tecnica di isolamento e applicazione è importante per gli studi su modelli animali della salute polmonare e del danno polmonare per ottenere una comprensione più approfondita degli aspetti cellulari del metabolismo dei retinoidi nei polmoni e delle comunicazioni cellulari mediate dai lipidi.

Introduzione

I retinoidi (vitamina A e suoi metaboliti) sono un componente lipidico essenziale del microambiente alveolare e il metabolismo e la segnalazione dei retinoidi specifici del tipo di cellula sono necessari per mantenere la salute funzionale del polmone in via di sviluppo e adulto 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14. Le cellule polmonari utilizzano percorsi specifici, consentendo l'assorbimento efficiente dei retinoidi circolanti di derivazione dietetica dal sangue come retinolo (ROH)15,16,17,18,19, seguita dalla conversione intracellulare graduale di ROH nella specie retinoide trascrizionalmente attiva, l'acido all-trans-retinoico (ATRA)20. La segnalazione mediata da ATRA (o retinoide-mediata) si ottiene attraverso l'interazione di ATRA con i suoi tre distinti recettori ormonali nucleari affini, i recettori dell'acido retinoico (RARα, RARβ e RARγ21,22), ed è fondamentale per regolare l'alveolarizzazione polmonare 23,24,25,26,27,28,29, la produzione di tensioattivi 30,31,32,33,34,35, angiogenesi36, permeabilità37 e immunità 38,39,40. È importante sottolineare che specifiche cellule polmonari, in particolare i fibroblasti polmonari, possono accumulare retinoidi sotto forma di esteri retinilici (RE), che possono essere immagazzinati o ulteriormente mobilizzati come ROH per il trasferimento alle cellule vicine quando necessario1.

La complessità del metabolismo e della segnalazione dei retinoidi, così come la complessità cellulare del polmone, rendono difficili gli studi volti a esplorare il metabolismo dei retinoidi nel polmone in vivo . Abbiamo delineato un protocollo semplice e robusto per isolare le cellule contenenti retinoidi (Figura 1) da popolazioni di cellule polmonari altamente eterogenee utilizzando l'autofluorescenza retinoide specifica (l'emissione a 455 nm dopo eccitazione a 350 nm) e impiegando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Il protocollo non richiede un'ulteriore marcatura cellulare, ad eccezione della colorazione di vitalità, se l'obiettivo dello studio è isolare e caratterizzare le cellule polmonari vive primarie in base alla loro capacità di immagazzinare retinoidi. Ciò riduce significativamente il tempo di preparazione per lo smistamento delle cellule, elimina la necessità di ulteriori colorazioni e consente di isolare rese elevate di cellule primarie vitali. Tuttavia, se l'obiettivo dello studio è isolare e caratterizzare specifiche popolazioni di cellule polmonari (fibroblasti, cellule endoteliali, epiteliali o immunitarie), è possibile eseguire un'ulteriore selezione cellulare dopo aver etichettato le cellule contenenti retinoidi selezionate con anticorpi specifici per le cellule.

L'autofluorescenza dei retinoidi è stata utilizzata in studi pubblicati per stabilire l'identità delle cellule contenenti retinoidi e/o per quantificare l'abbondanza di queste cellule nel fegato 41,42,43,44, nel pancreas 45,46, nei reni 41,47 e nel polmone41. Inoltre, diversi gruppi di ricerca hanno riportato l'uso della fluorescenza retinoide per isolare mediante FACS e studiare cellule primarie contenenti retinoidi da tessuti viventi, tra cui fegato 44,48,49,50,51,52,53 e polmone 1. Nell'attuale protocollo, mostriamo come specifiche popolazioni cellulari possano essere marcate in vivo prima di isolare le cellule contenenti retinoidi utilizzando tdTomato (proteina fluorescente rossa). Le caratteristiche spettrali di tdTomato (l'emissione a 581 nm dopo l'eccitazione a 554 nm54) e la luminosità non interferiscono con l'autofluorescenza dei retinoidi e, quindi, rendono conveniente ottenere la specificità cellulare durante lo smistamento. Dato il ruolo critico del metabolismo e della segnalazione dei retinoidi non compromessi all'interno del normale microambiente alveolare1, la tecnica descritta di isolamento delle cellule polmonari è uno strumento utile negli studi su modelli animali della salute e della malattia polmonare per ottenere una comprensione più approfondita degli aspetti cellulari del metabolismo dei retinoidi nei polmoni e delle comunicazioni cellulari mediate dai lipidi in vivo.

Protocollo

Tutte le procedure e gli esperimenti descritti che coinvolgono i topi sono stati eseguiti con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Rutgers University (IACUC ID: PROTO202200111) secondo i criteri delineati nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio preparata dalla National Academy of Sciences55.

1. Considerazioni e preparativi per l'esperimento

  1. Zootecnia e manipolazioni
    NOTA: Negli studi possono essere utilizzati topi maschi e femmine di tre mesi (10-12 settimane). Negli esperimenti descritti sono stati utilizzati topi carenti di lecitina:retinolo aciltransferasi (Lrat-deficient, Lrat-/- topi56) con un background genetico C57BL/6J e compagni di cucciolata di pari età (wild type, topi Lrat+/+). I topi che esprimono il gene tdTomato nei fibroblasti (topi F-tdT) sono stati generati incrociando topi che ospitano una cassetta reporter tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, ceppo Jackson Lab #007914) con topi Col1a2-CreER (B6. Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, ceppo Jackson Lab #029567).
    1. Utilizzare il modello murino che esprime Cre, una delle tante opzioni disponibili per etichettare la popolazione di cellule bersaglio in vivo.
      NOTA: A seconda della scelta della cellula bersaglio, dell'espressione di Cre, dell'efficienza della ricombinazione mediata da Cre e della specificità cellulare, i ricercatori possono utilizzare qualsiasi modello murino affidabile che esprime Cre.
    2. Utilizzare l'espressione del transgene tdTomato (dopo il trattamento con tamoxifene come descritto di seguito) per marcare i fibroblasti Col1a2+ , seguito dal loro isolamento da sospensioni di singole cellule del polmone digerito come descritto di seguito.
  2. Ricombinazione cre-mediata e attivazione transgenica in vivo
    1. Indurre l'espressione di Cre nei topi F-tdT attraverso l'iniezione intraperitoneale (IP) di 2 mg di tamoxifene una volta ogni 24 ore per un totale di 5 giorni consecutivi.
    2. Sanificare il sito di iniezione con etanolo al 70% prima dell'iniezione. Usa i topi per esperimenti 1 mese dopo l'iniezione finale di tamoxifene.
    3. Verificare l'efficacia della ricombinazione Cre prima degli esperimenti di smistamento. Confermare l'efficace ricombinazione di Cre e l'espressione di tdTomato isolando la popolazione di cellule bersaglio di fibroblasti polmonari dai topi F-tdT trattati con tamoxifene utilizzando biglie magnetiche anti-Pdgfrα e smistamento cellulare attivato magneticamente (MACS).
  3. Preparazione di soluzioni, plastica e vetreria
    NOTA: Le tecniche asettiche devono essere seguite per le procedure descritte di seguito. Le procedure che coinvolgono la preparazione della soluzione, la digestione dei tessuti e l'isolamento cellulare devono essere eseguite sotto la cappa laminare. Le soluzioni devono essere sterilizzate mediante filtrazione con un filtro da 0,2 μm; Gli strumenti chirurgici e il materiale da laboratorio devono essere sterilizzati in autoclave.
    1. Sotto la cappa laminare, preparare la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS), priva di calcio e magnesio (HBSS senza Ca2+/Mg2+, contenente 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 4,2 mM NaHCO3, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 5,6 mM D-glucosio) per la perfusione polmonare (5 mL per topo). Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm e riempire la siringa con la soluzione.
    2. Sotto la cappa laminare, preparare la soluzione salina bilanciata di Hanks con calcio e magnesio (HBSS con Ca2+/Mg2+, contenente 1,3 mM di CaCl2, 0,5 MgCl2·6H2O, 0,4 mM MgSO4·7H2O, 5,3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 4,2 mM NaHCO3, 137,9 mM NaCl, 0,3 mM Na2HPO4, 5,6 mM D-Glucosio), contenenti 0,3 mg/mL di collagenasi di tipo IV e 1 mg/mL di dispasi per la perfusione polmonare (10 mL per topo). Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm e riempire la siringa con la soluzione.
    3. Sotto la cappa laminare, preparare HBSS con Ca2+/Mg2+, contenente 0,3 mg/mL di collagenasi di tipo IV, 1 mg/mL di dispasi e 5 mg/mL di DNasi I per la digestione polmonare (10 mL per topo). Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm e riempire la siringa con la soluzione.
    4. Sotto la cappa laminare, riempire una piastra per colture cellulari (35 mm 10 mm, una piastra per ogni polmone raccolto da un topo) con 2 mL di HBSS sterile con Ca2+/Mg2+. Mettere i piatti contenenti HBSS con Ca2+/Mg2+ sul ghiaccio.

2. Perfusione polmonare, digestione e raccolta di sospensioni monocellulari

  1. Anestetizzare il topo somministrando un cocktail di anestesia contenente 10 mg/mL di ketamina e 2 mg/mL di xilazina alla dose di 0,01 mL/g di peso corporeo tramite iniezione IP.
  2. Assicurati che il topo sia in un profondo stato di incoscienza valutando una risposta al pizzicamento del dito del piede. Rimuovere i peli sciolti e lo sporco/detriti visibili dal sito chirurgico, tagliare e pulire il sito chirurgico con un panno con alcol al 70% per la disinfezione.
  3. Utilizzando strumenti chirurgici sterili, aprire le cavità addominali e toraciche. Taglia le costole e il diaframma per esporre i polmoni e il cuore.
    NOTA: Ciò assicurerà una morte istantanea poiché la toracotomia causerà una cessazione della respirazione mentre il topo è anestetizzato; Se eseguita correttamente, questa parte della procedura richiederà fino a 3 minuti dall'inizio della procedura fino alla toracotomia, seguita dalla morte dell'animale.
  4. Tagliare la vena cava inferiore e applicare un tampone assorbente per assorbire il sangue rilasciato.
  5. Perfondere i polmoni in situ attraverso il ventricolo destro del cuore utilizzando una siringa da 10 ml con un ago da 25 G X 1" riempito con 5 ml di HBSS sterile senza Ca2+/Mg2+. Se la perfusione ha successo, il tessuto polmonare diventerà bianco.
  6. Perfondere i polmoni in situ utilizzando una siringa da 10 mL con un ago da 25 G X 1" riempito con 10 mL di HBSS sterile con Ca2+/Mg2+, contenente collagenasi di tipo IV (0,3 mg/mL) e dispasi (1 mg/mL).
  7. Rimuovere i polmoni e trasferirli in una piastra di coltura cellulare (35 mm X 10 mm) con 2 mL di HBSS sterile con Ca2+/Mg2+.
  8. Sotto la cappa laminare, sciacquare i polmoni e tritarli in piccoli pezzi utilizzando una lama chirurgica sterile (#20, adatta al manico #4). Trasferire il polmone macinato in una provetta da 15 mL aggiungendo i primi 5 mL di HBSS con Ca2+/Mg2+ contenente 0,3 mg/mL di collagenasi di tipo IV, 1 mg/mL di dispasi e 5 mg/mL di DNasi I al tessuto tritato e trasferendolo utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Raccogliere e trasferire i residui di tessuto tritato rimanenti lavando la piastra di coltura cellulare con i restanti 5 mL di HBSS con Ca2+/Mg2+ contenenti 0,3 mg/mL di collagenasi di tipo IV, 1 mg/mL di dispasi e 5 mg/mL di DNasi I.
  9. Incubare il tessuto polmonare tritato in HBSS con Ca2+/Mg2+ contenente 0,3 mg/mL di collagenasi di tipo IV, 1 mg/mL di dispasi e 5 mg/mL di DNasi I su uno shaker rotante mantenuto a 37 °C per 45 minuti. A ciascuno dei tre intervalli di 15 minuti, sotto la cappa laminare, passare il tessuto macinato 10 volte attraverso una pipetta sierologica da 10 ml per dissociare meglio le cellule.
  10. Far passare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro da 100 μm per raccogliere le singole cellule in una provetta da 50 mL contenente 20 mL di soluzione fredda per l'imaging di cellule vive (soluzione fisiologica contenente 20 mM di HEPES, pH 7,4) contenente meno del 5% di siero fetale bovino (FBS). Raccogliere le celle mediante centrifugazione a 500 g per 10 min a 4 °C.
  11. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi e lasciare la provetta per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) per eliminare gli eritrociti. Aggiungere 20 mL di soluzione fredda per l'imaging di cellule vive contenente meno del 5% di FBS. Raccogliere le celle mediante centrifugazione a 500 g per 10 min a 4 °C.
  12. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 20 mL di soluzione fredda per l'imaging di cellule vive contenente meno del 5% di FBS. Far passare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro da 40 μm per raccogliere singole cellule in una provetta da 50 mL contenente 20 mL di soluzione fredda per l'imaging di cellule vive contenente meno del 5% di FBS. Raccogliere le celle mediante centrifugazione a 500 g per 10 min a 4 °C.
  13. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di soluzione fredda per l'imaging di cellule vive contenente meno del 5% di FBS. Contare le cellule e regolare la concentrazione delle cellule a ~5-10 x 106 cellule/mL.

3. Isolamento di cellule polmonari contenenti retinoidi mediante smistamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS)

  1. Prendi un'aliquota di sospensione cellulare e mettila da parte per essere utilizzata come controllo di iniezione non colorato. Aggiungere il colorante vitale SYTOX Green alla sospensione cellulare rimanente (diluizione 1:1000, concentrazione finale 30 nM).
  2. Far passare le sospensioni cellulari attraverso il filtro collegato alla provetta di raccolta in polistirene da 5 mL (12 x 75 mm).
  3. Procedere con l'isolamento delle cellule FACS ordinando le singole cellule vive contenenti retinoidi in base alla loro emissione a 455 nm. Eseguire la discriminazione singoletto in sequenza utilizzando un grafico per la dispersione diretta (altezza di dispersione in avanti/FSC-H rispetto all'area di dispersione in avanti/FSC-A). Escludere le cellule morte mediante le caratteristiche di dispersione (dispersione laterale) e la colorazione con SYTOX Green.
  4. Gate, smistamento e raccolta di singole cellule vive contenenti retinoidi utilizzando l'emissione a 455 nm dopo l'eccitazione a 350 nm.
    NOTA: Utilizzando la procedura descritta, è possibile raccogliere circa 5,105 cellule polmonari contenenti retinoidi da un polmone di topo.
  5. Eseguire l'analisi dei dati FACS utilizzando il software di citometria a flusso.

Risultati

Isolamento di cellule polmonari contenenti retinoidi
I polmoni di topo (da topi Lrat+/+ e Lrat-/-) sono stati digeriti enzimaticamente e le sospensioni di singole cellule sono state preparate e sottoposte a FACS secondo la procedura sopra descritta. Lo smistamento delle celle e l'acquisizione dei dati sono stati eseguiti su un sistema di smistamento cellulare Cytek Aurora™ gestito da...

Discussione

La capacità di rilevamento della vitamina A nei tessuti umani e animali e la sua visualizzazione istologica mediante microscopia a fluorescenza è stata riportata per la prima volta già negli anni '4059,60. Il fenomeno dell'autofluorescenza dei retinoidi è stato poi applicato con successo a studi volti a localizzare alte concentrazioni di vitamina A nei tessuti in vitro61 e a caratterizzare la ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del National Institutes of Health/National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH/NHLBI) R01 HL171112 (a I.S.), un premio per lo sviluppo della carriera (a I.S) da Rutgers Center for Environmental Exposures & Disease finanziato dal National Institutes of Health/National Institute of Environmental Health Sciences (NIH/NIEHS) P30 ES005022, e fondi di avviamento da Rutgers, The State University of New Jersey (a I.S.). Gli autori desiderano ringraziare il personale dell'Immune Monitoring and Flow Cytometry Shared Resource presso il Rutgers Cancer Institute (supportato, in parte, con finanziamenti dall'NCI-CCSG P30CA072770-5920) per i loro contributi al lavoro presentato in questo manoscritto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL serological pipetteAvantor/VWR76452-284
100 µm strainer Greiner Bio-One542000
15 mL falcon tubeCorning352099
40 µm strainer Greiner Bio-One542040
50 mL falcon tubeCorning352070
Cell culture dish, 35 mm ´ 10 mmCorning430165
Cell sorting mediaGibcoA59688DJ
Collagenase type IV Worthington Biochemical CorporationLS004188 
Cytek Aurora Cell Sorter System Cytek Biosciences
Dispase IISigma-AldrichD4693
DNase ISigma-AldrichDN25
Falcon brand 5-ml polypropylene round bottom tube, 12 mm ´ 75 mmCorning352063
Falcon brand 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap, 12 mm ´ 75 mmCorning352235
FlowJo software Becton Dickinsonflow cytometry software
HBSS with Ca2+/Mg2+Gibco14925-092
HBSS without Ca2+/Mg2+Gibco14175-095
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top FiltersThermoFisher595-3320
Red Cell lysis bufferSigma-AldrichR7757
SpectroFlo CS software Cytek BiosciencesVersion 1.3.0 
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel BladesFisher Scientific22-079-683
SYTOX Green dead cell stainInvitrogenS34860
TamoxifenSigma-AldrichT2859

Riferimenti

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