細胞選別による肺レチノイド含有細胞の単離

要約

以下に記載するプロトコルは、特異的なレチノイド自家蛍光を利用し、蛍光活性化細胞ソーティングを採用することにより、非常に不均一な肺細胞集団からレチノイド含有細胞を単離する簡単で効果的な方法です。

要約

レチノイド(ビタミンAとその代謝物)は、肺胞微小環境の必須脂質成分であり、細胞型特異的なレチノイド代謝は、発育中および成人の肺の機能的健康を維持するために必要です。肺細胞は特定の経路を利用するため、血液中の循環レチノイドをレチノール(ROH)として効率的に取り込み、その後、ROHを細胞内で段階的に転写活性なレチノイド種であるオールトランスレチノイン酸(ATRA)に変換することができます。ATRAを介した(またはレチノイドを介した)シグナル伝達は、肺胞形成、界面活性剤産生、血管新生、透過性、および免疫の調節に重要です。重要なことは、線維芽細胞を含む特定の肺細胞は、レチニルエステル(RE)の形でレチノイドを蓄積する可能性があり、それを保存したり、必要に応じてROHとしてさらに動員して隣接する細胞に移すことができます。肺レチノイド含有細胞は、レチノイド自家蛍光(350 nmでの励起に対して455 nmでの発光)を利用し、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用することにより、消化された肺の単一細胞懸濁液から単離および収集できます。赤色蛍光タンパク質による肺細胞の細胞特異的 なin vivo 標識により、特定のレチノイド含有肺細胞集団を単離および収集することができます。採取した細胞は、細胞の形態、遺伝子発現、薬理学的操作に対する応答性をさらに解析するために、直接解析または培養することができます。この単離と応用の技術は、肺の健康と肺損傷の動物モデル研究にとって重要であり、肺のレチノイド代謝と脂質媒介性細胞通信の細胞的側面についてより深い洞察を得ることができます。

概要

レチノイド(ビタミンAとその代謝産物)は、肺胞微小環境の必須脂質成分であり、細胞型特異的なレチノイド代謝とシグナル伝達は、発生中および成人の肺の機能的健康を維持するために必要である1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ^{、12、13、14}。肺細胞は特定の経路を利用し、血中循環する食事由来のレチノイドをレチノール(ROH)15,16,17,18,19として効率的に取り込み、続いてROHを細胞内で段階的にROHから転写活性なレチノイド種であるオールトランスレチノイン酸(ATRA)^{に変換することを可能にします20}.ATRA媒介(またはレチノイド媒介)シグナル伝達は、ATRAと3つの異なる同族核ホルモン受容体、レチノイン酸受容体(RARα、RARβ、およびRARγ21,22)との相互作用によって達成され、肺胞形成23,24,25,26,27,28,29、界面活性剤産生³⁰の調節に重要である^、31,32,33,34,35、血管新生³⁶、透過性³⁷、および免疫38,39,40。重要なことに、特定の肺細胞、特に肺線維芽細胞は、レチニルエステル(RE)の形でレチノイドを蓄積することができ、これは保存されるか^{、または必要に応じて}隣接する細胞に移すためにROHとしてさらに動員することができる1。

レチノイド代謝とシグナル伝達の複雑さ、および肺の細胞の複雑さにより、in vivo での肺のレチノイド代謝の調査を目的とした研究は困難になっています。私たちは、特異的なレチノイド自家蛍光(350 nmで励起すると455 nmで発光する)を利用し、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を採用することにより、非常に不均一な肺細胞集団からレチノイド含有細胞(図1)を単離するためのシンプルで堅牢なプロトコルを概説しました。このプロトコルでは、研究の目標がレチノイドを貯蔵する能力に基づいて初代生肺細胞を分離し、特徴付けることである場合、生存率染色を除いて、追加の細胞標識は必要ありません。これにより、細胞ソーティングの調製時間が大幅に短縮され、追加の染色が不要になり、生細胞の高収率の単離が可能になります。ただし、研究の目標が特定の肺細胞集団(線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、または免疫細胞)を単離して特徴付けることである場合、選別されたレチノイド含有細胞を細胞特異的抗体で標識した後、追加の細胞選別を実行できます。

レチノイド自家蛍光は、レチノイド含有細胞の同一性を確立するため、および/または肝臓^{41、42、43、44}、膵臓^45、46、腎臓^41、47、および肺⁴¹におけるこれらの細胞の存在量を定量化するために、公開された研究で使用されてきた.さらに、いくつかの研究グループは、レチノイド蛍光を使用してFACSによって単離し、肝臓^{44、48、49、50、51、52、53} 、肺¹などの生体組織から初代レチノイド含有細胞を研究したことを報告しています。現在のプロトコルでは、tdTomato(赤色蛍光タンパク質)を使用してレチノイド含有細胞を単離する前に、特定の細胞集団を in vivo で標識する方法を示します。tdTomatoのスペクトル特性(554 nmでの励起に対する581 nmでの発光⁵⁴)および輝度は、レチノイド自家蛍光を妨げないため、ソーティング中に細胞特異性を達成するのに便利です。正常な肺胞微小環境¹におけるレチノイド代謝とシグナル伝達が損なわれない重要な役割を考えると、記載されている肺細胞単離技術は、肺の健康と疾患の動物モデル研究において、肺のレチノイド代謝の細胞的側面と in vivoでの脂質媒介性細胞通信についてより深い洞察を得るための有用なツールです。

プロトコル

マウスを含むすべての記載された手順および実験は、全米科学アカデミーが作成した実験動物のケアおよび使用に関するガイド⁵⁵に概説されている基準に従って、ラトガース大学の動物管理および使用委員会(IACUC)(IACUC ID:PROTO202200111)の承認を得て実施されました。

1. 実験の検討事項と準備

1. 畜産と操作
   注:生後3か月(10〜12週齢)の雄マウスと雌マウスを研究に使用できます。記載された実験では、C57BL/6J遺伝的背景を持つレシチン:レチノールアシルトランスフェラーゼ欠損マウス(Lrat欠損、Lrat^-/-マウス⁵⁶)および年齢一致同腹仔(野生型、Lrat^+/+マウス)を用いた。tdTomatoレポーターカセット(B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J, Jackson Lab strain #007914) とCol1a2-CreERマウス (B6.Cg-Tg(Col1A2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, ジャクソンラボ株 #029567).
   1. in vivoで標的細胞集団を標識するための多くの利用可能なオプションの1つであるCre発現マウスモデルを採用します。
      注:標的細胞の選択、Cre発現、Cre媒介組換えの効率、および細胞特異性に応じて、研究者は任意の信頼性の高いCre発現マウスモデルを利用できます。
   2. tdTomato導入遺伝子発現(後述のタモキシフェン処理時)を使用して Col1a2⁺ 線維芽細胞を標識し、続いて以下に説明するように消化された肺の単一細胞懸 ?? 液から単離します。.
2. Creを介した組換えとin vivo導入遺伝子活性化
   1. 2 mg のタモキシフェンを 24 時間ごとに 1 回、合計 5 日間連続して腹腔内 (IP) 注射することにより、F-tdT マウスに Cre 発現を誘導します。
   2. 注射前に70%エタノールで注射部位を消毒してください。マウスを実験に使用して、最終的なタモキシフェン注射の1か月後。
   3. 選別実験の前にCre組換えの有効性を確認してください。タモキシフェン処理F-tdTマウスから抗Pdgfrα 磁気ビーズと磁気活性化セルソーティング(MACS)を用いて肺線維芽細胞の標的細胞集団を単離することにより、Cre組換えとtdTomatoの発現が効果的であることを確認しました。
3. 溶液の調製、プラスチックおよびガラス製品
   注:以下に説明する手順では、無菌技術に従う必要があります。溶液調製、組織消化、および細胞単離を含む手順は、層流フードの下で行う必要があります。溶液は、0.2μmフィルターを使用したろ過により滅菌する必要があります。手術器具や実験器具は、オートクレーブ滅菌する必要があります。
   1. 層流フードの下で、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液(HBSS、Ca²⁺/Mg²⁺を含まないHBSS、5.3 mM KCl、0.4 mM KH₂PO₄、4.2 mM NaHCO₃、137.9 mM NaCl、0.3 mM Na₂HPO₄、5.6 mM D-グルコースを含む)を肺灌流用(マウスあたり5 mL)に調製します。0.2 μmフィルターを使用して溶液を滅菌し、シリンジに溶液を充填します。
   2. 層流フードの下で、カルシウムとマグネシウム(Ca^{2 +} / Mg^{2 +}のHBSS、1.3 mM CaCl₂、0.5 MgCl_2を含むHBSS)を含むハンクスの平衡塩溶液を準備します。6H₂O, 0.4 mM MgSO_4·7H₂O、5.3 mM KCl、0.4 mM KH₂PO₄、4.2 mM NaHCO₃、137.9 mM NaCl、0.3 mM Na₂HPO₄、5.6 mM D-Glucose)、0.3 mg/mL の IV 型コラゲナーゼと 1 mg/mL の肺灌流用ディスパーゼを含む (マウスあたり 10 mL)。0.2 μmフィルターを使用して溶液を滅菌し、シリンジに溶液を充填します。
   3. 層状フードの下で、0.3 mg/mL の IV 型コラゲナーゼ、1 mg/mL のディスパーゼ、および 5 mg/mL の肺消化用 DNase I を含む Ca²⁺/Mg²⁺ で HBSS を調製します (マウスあたり 10 mL)。0.2 μmフィルターを使用して溶液を滅菌し、シリンジに溶液を充填します。
   4. 層流フードの下に、細胞培養ディッシュ(35 mm 10 mm、マウス1匹から採取した肺1枚につき1ディッシュ)に、Ca²⁺/Mg²⁺の滅菌HBSS2 mLを入れます。Ca^{2 +} / Mg^{2 +} のHBSSを含む皿を氷の上に置きます。

2. 肺灌流、消化、および単一細胞懸濁液の採取

1. 10 mg/mL ケタミンと 2 mg/mL キシラジンを含む 10 mg/mL キシラジンを 0.01 mL/g 体重の用量で IP 注射してマウスに麻酔をかけます。
2. マウスが深い意識不明の状態にあることを確認するために、つま先のつま先つまみの反応を評価します。手術部位から抜け毛や目に見える汚れ/破片を取り除き、消毒のために70%アルコールを使用して手術部位をクリップして拭き取ります。
3. 滅菌済みの手術器具を使用して、腹腔と胸腔を開きます。肋骨と横隔膜を切って、肺と心臓を露出させます。
   注:これにより、マウスが麻酔されている間、開胸術により呼吸が停止するため、即死が保証されます。適切に行われた場合、手順のこの部分は、手順の開始から開胸術、その後の動物の死まで最大3分かかります。
4. 下大静脈を切開し、放出された血液を吸収するために吸収パッドを塗布します。
5. Ca²⁺/Mg²⁺を含まない5 mLの滅菌HBSSを充填した25 G X 1インチの針を備えた10 mLシリンジを使用して、心臓の右心室を通じて肺をその場で灌流します。灌流が成功すると、肺組織は白くなります。
6. IV型コラゲナーゼ(0.3 mg/mL)およびディスパーゼ(1 mg/mL)を含むCa²⁺/Mg²⁺を含む10 mLの滅菌HBSSを充填した25 G X 1インチ針を備えた10 mLシリンジを使用して、in situで肺を灌流します。
7. 肺を取り出し、Ca²⁺/Mg²⁺を含む2 mLの滅菌HBSSを入れた細胞培養皿(35 mm X 10 mm)に移します。
8. 層状フードの下で、肺をすすぎ、滅菌外科用ブレード(#20、ハンドル#4に適合)を使用して肺を細かく刻みます。0.3 mg/mL の IV 型コラゲナーゼ、1 mg/mL のディスパーゼ、5 mg/mL の DNase I を含む Ca²⁺/Mg²⁺ を含む HBSS の最初の 5 mL をミンチ組織に加え、10 mL 血清ピペットを使用して移すことにより、ミンチした肺を 15 mL チューブに移します。0.3 mg/mLのIV型コラゲナーゼ、1 mg/mLのディスパーゼ、および5 mg/mLのDNase Iを含むCa²⁺/Mg²⁺ を含む残りの5 mLのHBSSで細胞培養皿を洗浄することにより、残りのミンチ組織残渣を回収して移します。
9. 0.3 mg/mLのIV型コラゲナーゼ、1 mg/mLのディスパーゼ、および5 mg/mLのDNase Iを含むCa²⁺/Mg²⁺ を含むHBSSで、37°Cに45分間維持した回転式シェーカーで、ミンチした肺組織をインキュベートします。3回の15分間隔のそれぞれで、層状フードの下で、ミンチ組織を10mLの血清ピペットに10回通過させ、細胞をよりよく解離させます。
10. 得られた細胞懸濁液を100 μmストレーナに通し、20 mLの冷生細胞イメージング溶液(20 mM HEPESを含む生理食塩水、pH 7.4)を含む50 mLチューブに単一細胞を回収し、5%未満のウシ胎児血清(FBS)を含有します。細胞を500 g で4°Cで10分間遠心分離して回収します。
11. 上清を吸引し、細胞ペレットを赤血球溶解バッファー1 mLに再懸濁し、チューブを室温(RT)で5分間放置して赤血球を除去します。5% FBS 未満の 20 mL のコールド ライブ セル イメージング ソリューションを添加します。細胞を500 g で4°Cで10分間遠心分離して回収します。
12. 上清を吸引し、5% FBS 未満の 20 mL の冷たい生細胞イメージング溶液に細胞ペレットを再懸濁します。得られた細胞懸濁液を40 μmのストレーナに通し、5% FBS未満の20 mLの冷生細胞イメージング溶液を含む50 mLのチューブに単一細胞を回収します。細胞を500 g で4°Cで10分間遠心分離して回収します。
13. 上清を吸引し、5% FBS 未満の 10 mL の冷たい生細胞イメージング溶液に細胞ペレットを再懸濁します。細胞をカウントし、細胞濃度を ~5-10 x 10⁶ cells/mL に調整します。

3. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) によるレチノイド含有肺細胞の単離

1. 細胞懸濁液のアリコートを取り出し、染色されていないゲーティングコントロールとして使用するために取っておきます。生存率色素SYTOX Greenを残りの細胞懸濁液(1:1000希釈、最終濃度30 nM)に加えます。
2. 細胞懸濁液をポリスチレン5 mL(12 x 75 mm)収集チューブに取り付けられたフィルターに通します。
3. 455 nmでの発光に基づいて、生きた個々のレチノイド含有細胞を選別することにより、FACS細胞の単離を進めます。前方散布図のプロットを使用して、逐次的な一重項識別を実行します (前方散布図の高さ/FSC-H 対前方散布図面積/FSC-A)。散乱特性(側方散乱)とSYTOX Greenによる染色により、死細胞を除外します。
4. 350 nmでの励起時に455 nmでの発光を使用して、単一の生きたレチノイド含有細胞をゲート、ソーティング、および収集します。
   注:記載された手順を用いて、約5・10⁵ 個のレチノイド含有肺細胞を1つのマウス肺から収集することができる。
5. フローサイトメトリーソフトウェアを使用してFACSデータ解析を実施します。

結果

肺レチノイド含有細胞の単離
マウス肺(Lrat^+/+およびLrat^-/-由来)マウスを酵素的に消化し、上記で概説した手順に従って単一細胞懸濁液を調製し、FACSに供した。細胞のソーティングとデータ取得は、SpectroFlo CSソフトウェアバージョン1.3.0で操作するCytek Aurora™セルソーターシステムで、100 μm...

ディスカッション

ヒトおよび動物の組織におけるビタミンA検出の能力と、蛍光顕微鏡を用いたその組織学的可視化は、1940年代に初めて報告された^59,60。その後、レチノイド自家蛍光の現象は、in vitroで組織中の高濃度のビタミンAの位置を特定することを目的とした研究に首尾よく適用され⁶¹、蛍光顕微鏡を用いて動?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipette	Avantor/VWR	76452-284
100 µm strainer	Greiner Bio-One	542000
15 mL falcon tube	Corning	352099
40 µm strainer	Greiner Bio-One	542040
50 mL falcon tube	Corning	352070
Cell culture dish, 35 mm ´ 10 mm	Corning	430165
Cell sorting media	Gibco	A59688DJ
Collagenase type IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004188
Cytek Aurora Cell Sorter System	Cytek Biosciences
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
Falcon brand 5-ml polypropylene round bottom tube, 12 mm ´ 75 mm	Corning	352063
Falcon brand 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap, 12 mm ´ 75 mm	Corning	352235
FlowJo software	Becton Dickinson		flow cytometry software
HBSS with Ca2+/Mg2+	Gibco	14925-092
HBSS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-095
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters	ThermoFisher	595-3320
Red Cell lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
SpectroFlo CS software	Cytek Biosciences	Version 1.3.0
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades	Fisher Scientific	22-079-683
SYTOX Green dead cell stain	Invitrogen	S34860
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T2859