בידוד תאים המכילים רטינואיד ריאה על ידי מיון תאים

Summary

הפרוטוקול המתואר להלן הוא דרך פשוטה ויעילה לבודד תאים המכילים רטינואיד מאוכלוסיות תאי ריאה הטרוגניות מאוד על ידי שימוש באוטופלואורסצנציה ספציפית של רטינואיד ועל ידי שימוש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט.

Abstract

רטינואידים (ויטמין A והמטבוליטים שלו) הם מרכיב שומני חיוני במיקרו-סביבה המכתשית, ומטבוליזם רטינואיד ספציפי לסוג התא נדרש כדי לשמור על הבריאות התפקודית של הריאות המתפתחות והבוגרות. תאי ריאה משתמשים במסלולים ספציפיים, המאפשרים קליטה יעילה של רטינואידים במחזור הדם כרטינול (ROH), ואחריו המרה הדרגתית תוך תאית של ROH לזן הרטינואיד הפעיל מבחינה שעתוק, חומצה טרנס-רטינואית (ATRA). איתות בתיווך ATRA (או בתיווך רטינואיד) הוא חיוני לוויסות אלבאולריזציה של הריאות, ייצור פעילי שטח, אנגיוגנזה, חדירות וחסינות. חשוב לציין, תאי ריאה ספציפיים, כולל פיברובלסטים, יכולים לצבור רטינואידים בצורה של אסטרי רטיניל (RE), אותם ניתן לאחסן או לגייס עוד יותר כ-ROH להעברה לתאים השכנים בעת הצורך. ניתן לבודד ולאסוף תאים המכילים רטינואיד ריאה מהתרחיף התא הבודד של ריאות מעוכלות על ידי שימוש באוטופלואורסצנציה רטינואידית (הפליטה ב-455 ננומטר בעת עירור ב-350 ננומטר) ועל ידי שימוש במיון תאים המופעל פלואורסצנטי (FACS). תיוג נוסף ספציפי לתאים in vivo של תאי ריאה עם חלבון פלואורסצנטי אדום מאפשר בידוד ואיסוף אוכלוסיות תאי ריאה ספציפיות המכילות רטינואיד. ניתן לנתח או לתרבית ישירות את התאים שנאספו לצורך ניתוחים נוספים של מורפולוגיה של תאים, ביטוי גנים והיענות למניפולציות פרמקולוגיות. טכניקה זו של בידוד ויישום חשובה למחקרי מודלים של בעלי חיים של בריאות הריאות ופגיעה ריאתית כדי לקבל תובנה מעמיקה יותר לגבי היבטים תאיים של חילוף חומרים רטינואיד בריאות ותקשורת תאית בתיווך שומנים.

Introduction

רטינואידים (ויטמין A והמטבוליטים שלו) הם מרכיב שומני חיוני במיקרו-סביבה המכתשית, ומטבוליזם ואיתות רטינואידים ספציפיים לסוג התא נדרשים כדי לשמור על הבריאות התפקודית של הריאה המתפתחת והבוגרת 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 ^,12,13,14. תאי ריאה משתמשים במסלולים ספציפיים, המאפשרים קליטה יעילה של רטינואידים שמקורם בתזונה במחזור הדם כמו רטינול (ROH)15,16,17,18,19, ואחריו המרה הדרגתית תוך תאית של ROH לזן הרטינואיד הפעיל מבחינה שעתוק, חומצה טרנס-רטינואית (ATRA)²⁰. איתות בתיווך ATRA (או בתיווך רטינואיד) מושג באמצעות אינטראקציה של ATRA עם שלושת קולטני ההורמונים הגרעיניים המקבילים שלו, קולטני חומצה רטינואית (RARα, RARβ ו-RARγ^21,22), והוא חיוני לוויסות אלבאולריזציה של הריאות 23,24,25,26,27,28,29, ייצור פעילי שטח ^30,31,32,33,34,35, אנגיוגנזה³⁶, חדירות³⁷ וחסינות 38,39,40. חשוב לציין, תאי ריאה ספציפיים, במיוחד פיברובלסטים של הריאות, יכולים לצבור רטינואידים בצורה של אסטרי רטיניל (RE), אותם ניתן לאחסן או לגייס עוד יותר כ-ROH להעברה לתאים השכנים בעת הצורך¹.

המורכבות של חילוף החומרים והאיתות של רטינואידים, כמו גם המורכבות התאית של הריאה, הופכים את המחקרים שמטרתם לחקור את חילוף החומרים של רטינואידים בריאה in vivo למאתגרים. תיארנו פרוטוקול פשוט וחזק לבידוד תאים המכילים רטינואיד (איור 1) מאוכלוסיות תאי ריאה הטרוגניות מאוד על ידי שימוש באוטופלואורסצנציה ספציפית של רטינואיד (הפליטה ב-455 ננומטר בעת עירור ב-350 ננומטר) ועל ידי שימוש במיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS). הפרוטוקול אינו דורש תיוג תאים נוסף למעט צביעת כדאיות אם מטרת המחקר היא לבודד ולאפיין תאי ריאה חיים ראשוניים על סמך יכולתם לאחסן רטינואידים. זה מפחית משמעותית את זמן ההכנה למיון התאים, מבטל את הצורך בצביעה נוספת ומאפשר בידוד תפוקות גבוהות של תאים ראשוניים ברי קיימא. עם זאת, אם מטרת המחקר היא לבודד ולאפיין אוכלוסיות ספציפיות של תאי ריאה (פיברובלסטים, אנדותל, אפיתל או תאים חיסוניים), ניתן לבצע מיון תאים נוסף לאחר תיוג התאים הממויינים המכילים רטינואיד בנוגדנים ספציפיים לתא.

אוטופלואורסצנציה רטינואידית שימשה במחקרים שפורסמו כדי לקבוע את זהותם של תאים המכילים רטינואיד ו/או לכמת את השפע של תאים אלה בכבד 41,42,43,44, בלבלב ^45,46, בכליות^41,47 ובריאה⁴¹. יתרה מכך, מספר קבוצות מחקר דיווחו על שימוש בפלואורסצנטיות רטינואידים לבידוד על ידי FACS ולחקור תאים ראשוניים המכילים רטינואיד מרקמות חיות, כולל כבד 44,48,49,50,51,52,53 וריאה 1. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מראים כיצד ניתן לסמן אוכלוסיות תאים ספציפיות in vivo לפני בידוד תאים המכילים רטינואיד באמצעות tdTomato (חלבון פלואורסצנטי אדום). המאפיינים הספקטרליים של tdTomato (הפליטה ב-581 ננומטר בעת עירור ב-554 ננומטר⁵⁴) והבהירות אינם מפריעים לאוטופלואורסצנציה של רטינואיד ולכן מקלים על השגת ספציפיות התא במהלך המיון. בהתחשב בתפקיד הקריטי של חילוף חומרים ואיתות רטינואידים ללא פשרות בתוך המיקרו-סביבה המכתשית הרגילה¹, הטכניקה המתוארת של בידוד תאי ריאה היא כלי שימושי במחקרי מודלים של בעלי חיים של בריאות ומחלות ריאות כדי לקבל תובנה עמוקה יותר לגבי היבטים תאיים של חילוף חומרים רטינואיד בריאות ותקשורת תאית מתווכת שומנים in vivo.

Protocol

כל ההליכים והניסויים המתוארים בעכברים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת ראטגרס (IACUC ID: PROTO202200111) על פי קריטריונים המפורטים במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שהוכן על ידי האקדמיה הלאומית למדעים⁵⁵.

1. שיקולים והכנות לניסוי

1. גידול בעלי חיים ומניפולציות
   הערה: ניתן להשתמש בעכברים זכרים ונקבות בני שלושה חודשים (10-12 שבועות) במחקרים. לציטין: עכברים חסרי רטינול אצילטרנספראז (חסרי לרט, עכברי Lrat^{-/- 56}) על רקע גנטי C57BL/6J וחברי המלטה תואמי גיל (סוג בר, עכברי Lrat^+/+) שימשו בניסויים המתוארים. עכברים המבטאים את הגן tdTomato בפיברובלסטים (עכברי F-tdT) נוצרו על ידי הכלאה של עכברים שהכילו קלטת כתב tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor^{tm14(CAG-tdTomato)Hze}/J, זן מעבדת ג'קסון #007914) עם עכברי Col1a2-CreER (B6. Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J, זן מעבדת ג'קסון #029567).
   1. השתמש במודל העכבר המבטא Cre, אחת מהאפשרויות הרבות הזמינות לתיוג אוכלוסיית תאי היעד in vivo.
      הערה: בהתאם לבחירת תא המטרה, ביטוי Cre, היעילות של רקומבינציה בתיווך Cre וספציפיות התא, החוקרים עשויים להשתמש בכל מודל עכבר אמין המבטא Cre.
   2. השתמש בביטוי טרנסגן tdTomato (לאחר טיפול בטמוקסיפן כמתואר להלן) כדי לתייג פיברובלסטים Col1a2⁺ , ולאחר מכן בידודם מתרחיפים של תאים בודדים של הריאה המעוכלת כמתואר להלן.
2. רקומבינציה מתווכת Cre והפעלת טרנסגנים in vivo
   1. לגרום לביטוי Cre בעכברי F-tdT באמצעות הזרקה תוך-צפקית (IP) של 2 מ"ג טמוקסיפן אחת ל-24 שעות למשך 5 ימים רצופים.
   2. יש לחטא את מקום ההזרקה עם 70% אתנול לפני ההזרקה. השתמש בעכברים לניסויים חודש לאחר הזרקת הטמוקסיפן הסופית.
   3. בדוק את היעילות של Cre-recombination לפני ניסויי המיון. אשר את הרקומבינציה היעילה של Cre וביטוי tdTomato על ידי בידוד אוכלוסיית תאי המטרה של פיברובלסטים ריאתיים מעכברי F-tdT שטופלו בטמוקסיפן באמצעות חרוזים מגנטיים נגד Pdgfrα ומיון תאים מופעל מגנטי (MACS).
3. הכנת פתרונות, כלי פלסטיק וזכוכית
   הערה: יש להקפיד על טכניקות אספטיות עבור ההליכים המתוארים להלן. ההליכים הכוללים הכנת תמיסה, עיכול רקמות ובידוד תאים צריכים להיעשות מתחת למכסה המנוע הלמינר. יש לעקר תמיסות על ידי סינון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר; יש לעקר כלים כירורגיים כמו גם כלי מעבדה על ידי חיטוי.
   1. מתחת למכסה המנוע, הכינו את תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של הנקס, נטולת סידן ומגנזיום (HBSS ללא Ca²⁺/Mg²⁺, המכילה 5.3 מ"מ KCl, 0.4 מ"מ KH₂PO₄, 4.2 מ"מ NaHCO₃, 137.9 מ"מ NaCl, 0.3 מ"מ Na₂HPO₄, 5.6 מ"מ D-גלוקוז) לזלוף ריאות (5 מ"ל לעכבר). עקרו את התמיסה באמצעות פילטר של 0.2 מיקרומטר ומלאו את המזרק בתמיסה.
   2. מתחת למכסה המנוע, הכינו את תמיסת המלח המאוזנת של הנקס עם סידן ומגנזיום (HBSS עם Ca²⁺/Mg²⁺, המכילה 1.3 מ"מ CaCl₂, 0.5 MgCl_2·6H₂O, 0.4 מ"מ MgSO_4·7H₂O, 5.3 mM KCl, 0.4 mM KH₂PO₄, 4.2 mM NaHCO₃, 137.9 mM NaCl, 0.3 mM Na₂HPO₄, 5.6 mM D-Glucose), המכילים 0.3 מ"ג/מ"ל של קולגנאז מסוג IV ו-1 מ"ג/מ"ל של דיספאז עבור זלוף הריאות (10 מ"ל לעכבר). עקרו את התמיסה באמצעות פילטר של 0.2 מיקרומטר ומלאו את המזרק בתמיסה.
   3. מתחת למכסה המנוע הלמינר, הכינו HBSS עם Ca²⁺/Mg²⁺, המכיל 0.3 מ"ג/מ"ל של קולגנאז מסוג IV, 1 מ"ג/מ"ל של דיספאז ו-5 מ"ג/מ"ל של DNase I לעיכול ריאות (10 מ"ל לעכבר). עקרו את התמיסה באמצעות פילטר של 0.2 מיקרומטר ומלאו את המזרק בתמיסה.
   4. מתחת למכסה המנוע הלמינר, מלאו צלחת תרבית תאים (35 מ"מ 10 מ"מ, צלחת אחת לכל ריאה שנאספה מעכבר אחד) ב -2 מ"ל HBSS סטרילי עם Ca²⁺/Mg²⁺. מניחים את הכלים המכילים HBSS עם Ca²⁺/Mg²⁺ על קרח.

2. זלוף ריאות, עיכול ואיסוף תרחיף חד-תאי

1. הרדמת העכבר על ידי מתן קוקטייל הרדמה המכיל 10 מ"ג/מ"ל קטמין ו-2 מ"ג/מ"ל קסילזין במינון של 0.01 מ"ל/גרם משקל גוף באמצעות הזרקת IP.
2. ודא שהעכבר נמצא במצב עמוק של חוסר הכרה על ידי הערכת תגובת צביטה בבוהן. הסר את השיער הרופף והלכלוך/פסולת הגלויים מאתר הניתוח, מהדק ונגב את אזור הניתוח באמצעות 70% אלכוהול לחיטוי.
3. בעזרת כלי ניתוח סטריליים, פתח את חללי הבטן והחזה. חותכים את הצלעות והסרעפת כדי לחשוף את הריאות והלב.
   הערה: זה יבטיח מוות מיידי מכיוון שבית החזה יגרום להפסקת נשימה בזמן שהעכבר מורדם; אם מבוצע כראוי, חלק זה של ההליך ייקח עד 3 דקות מתחילת ההליך ועד לכריתת בית החזה, ולאחר מכן מותו של בעל החיים.
4. חותכים את הווריד הנבוב התחתון ומורחים כרית סופגת כדי לספוג את הדם המשוחרר.
5. לחלחל את הריאות באתרן דרך החדר הימני של הלב באמצעות מזרק של 10 מ"ל עם מחט בגודל 25 גרם X 1 אינץ' מלאה ב-5 מ"ל של HBSS סטרילי ללא Ca²⁺/Mg²⁺. אם הזלוף יצליח, רקמת הריאה תהפוך לבנה.
6. יש להחדיר את הריאות באתרן באמצעות מזרק של 10 מ"ל עם מחט בגודל 25 גרם X 1 אינץ' מלאה ב-10 מ"ל של HBSS סטרילי עם Ca²⁺/Mg²⁺, המכיל קולגנאז מסוג IV (0.3 מ"ג/מ"ל) ודיספאאז (1 מ"ג/מ"ל).
7. הסר את הריאות והעביר אותן לתבנית תרבית תאים (35 מ"מ X 10 מ"מ) עם 2 מ"ל HBSS סטרילי עם Ca²⁺/Mg²⁺.
8. מתחת למכסה המנוע הלמינר, שטפו את הריאות וטחנו אותן לחתיכות קטנות באמצעות להב כירורגי סטרילי (#20, מתאים לידית #4). העבירו את הריאה הטחונה לתוך שפופרת של 15 מ"ל על ידי הוספת 5 מ"ל הראשונים של HBSS עם Ca²⁺/Mg²⁺ המכילים 0.3 מ"ג/מ"ל של קולגנאז מסוג IV, 1 מ"ג/מ"ל של דיספאז ו-5 מ"ג/מ"ל של DNase I לרקמה הטחונה והעברתה באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. אסוף והעביר את שאריות הרקמה הטחונה הנותרות על ידי שטיפת צלחת תרבית התאים עם 5 מ"ל הנותרים של HBSS עם Ca²⁺/Mg²⁺ המכיל 0.3 מ"ג/מ"ל של קולגנאז מסוג IV, 1 מ"ג/מ"ל של דיספאז ו-5 מ"ג/מ"ל של DNase I.
9. דגרו את רקמת הריאה הטחונה ב-HBSS עם Ca²⁺/Mg²⁺ המכיל 0.3 מ"ג/מ"ל של קולגנאז מסוג IV, 1 מ"ג/מ"ל של דיספאז ו-5 מ"ג/מ"ל של DNase I על שייקר מסתובב שנשמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. בכל אחד משלושת המרווחים של 15 דקות, מתחת למכסה המנוע הלמינר, העבירו את הרקמה הטחונה 10 פעמים דרך פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל כדי להפריד טוב יותר את התאים.
10. העבירו את תרחיף התאים שנוצר דרך מסננת של 100 מיקרומטר כדי לאסוף תאים בודדים לתוך צינור של 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל של תמיסת הדמיה של תאים חיים קרים (תמיסת מלח פיזיולוגית המכילה 20 מ"מ HEPES, pH 7.4) המכילה פחות מ-5% מסרום בקר עוברי (FBS). אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
11. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של מאגר ליזה של תאי דם אדומים והשאירו את הצינור למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לסלק אריתרוציטים. הוסף 20 מ"ל של תמיסת הדמיה של תאים חיים קרים המכילה פחות מ-5% FBS. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
12. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-20 מ"ל של תמיסת הדמיה של תאים חיים קרים המכילה פחות מ-5% FBS. העבירו את תרחיף התאים שנוצר דרך מסננת של 40 מיקרומטר כדי לאסוף תאים בודדים לתוך שפופרת של 50 מ"ל המכילה 20 מ"ל של תמיסת הדמיה של תאים חיים קרים המכילה פחות מ-5% FBS. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
13. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-10 מ"ל של תמיסת הדמיה של תאים חיים קרים המכילה פחות מ-5% FBS. ספרו את התאים והתאימו את ריכוז התאים ל-~5-10 x 10⁶ תאים/מ"ל.

3. בידוד תאי ריאה המכילים רטינואיד באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS)

1. קח מנה של תרחיף תאים והניח אותו בצד כדי לשמש כבקרת שער לא מוכתמת. הוסף צבע כדאיות SYTOX Green לתרחיף התא הנותר (דילול 1:1000, ריכוז סופי 30 ננומטר).
2. העבירו מתלי תאים דרך המסנן המחובר לצינור איסוף הפוליסטירן 5 מ"ל (12 x 75 מ"מ).
3. המשך בבידוד תאי FACS על ידי מיון תאים חיים בודדים המכילים רטינואיד על סמך פליטתם ב-455 ננומטר. בצע אפליה בודדת ברצף באמצעות תרשים לפיזור קדימה (גובה פיזור קדימה/FSC-H לעומת אזור פיזור קדימה/FSC-A). אל תכלול תאים מתים לפי מאפייני פיזור (פיזור צד) וצביעה בירוק SYTOX.
4. שער, מיון ואיסוף תאים בודדים, חיים, המכילים רטינואיד באמצעות פליטה ב-455 ננומטר בעת עירור ב-350 ננומטר.
   הערה: באמצעות ההליך המתואר, ניתן לאסוף כ-5.10⁵ תאי ריאה המכילים רטינואיד מריאת עכבר אחת.
5. לבצע ניתוח נתוני FACS באמצעות תוכנת זרימה ציטומטרית.

תוצאות

בידוד תאים המכילים רטינואיד ריאה
ריאות עכברים (מעכברי Lrat^{+/+ ו-Lrat-/-}) עוכלו אנזימטית, ותרחיפים חד-תאיים הוכנו ועברו ל-FACS בהתאם לנוהל המתואר לעיל. מיון תאים ואיסוף נתונים בוצעו במערכת מיון תאים של Cytek Aurora™ המופעלת על יד?...

Discussion

היכולת של זיהוי ויטמין A ברקמות אנושיות ובעלי חיים והדמיה היסטולוגית שלו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית דווחה לראשונה כבר בשנות ה-40 של המאה ה-20^59,60. התופעה של אוטופלואורסצנציה רטינואידית יושמה בהצלחה במחקרים שמטרתם לאתר ריכוזים גבוהים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipette	Avantor/VWR	76452-284
100 µm strainer	Greiner Bio-One	542000
15 mL falcon tube	Corning	352099
40 µm strainer	Greiner Bio-One	542040
50 mL falcon tube	Corning	352070
Cell culture dish, 35 mm ´ 10 mm	Corning	430165
Cell sorting media	Gibco	A59688DJ
Collagenase type IV	Worthington Biochemical Corporation	LS004188
Cytek Aurora Cell Sorter System	Cytek Biosciences
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
Falcon brand 5-ml polypropylene round bottom tube, 12 mm ´ 75 mm	Corning	352063
Falcon brand 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap, 12 mm ´ 75 mm	Corning	352235
FlowJo software	Becton Dickinson		flow cytometry software
HBSS with Ca2+/Mg2+	Gibco	14925-092
HBSS without Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-095
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters	ThermoFisher	595-3320
Red Cell lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
SpectroFlo CS software	Cytek Biosciences	Version 1.3.0
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades	Fisher Scientific	22-079-683
SYTOX Green dead cell stain	Invitrogen	S34860
Tamoxifen	Sigma-Aldrich	T2859