1. 纳米粒子注射和器官采集

1. 静脉注射纳米粒子到麻醉小鼠中，允许被动定向。
2. 在所需的时间点，即1、4和8周，注射后，根据美国兽医医学协会（AVMA）指南，人道地对小鼠实施安乐死。
3. 打开体腔，手术切除感兴趣的器官。将器官放入10%磷酸盐缓冲形式，放入聚丙烯容器中，直到样品制备。

2. 组织样品制备

1. 使用钳子将小鼠组织从固定转移到磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。摇动样品 30 分钟，每 10 分钟更换一次 PBS。
2. 取出组织，用抹布擦干。然后将其放入含有最佳切削温度化合物 （OCT） 的塑料模具中。储存在-80°C过夜。
3. 第二天，将样品转移到低温中，并将温度设置为-23°C。
4. 使用器官类型和纳米颗粒大小标记幻灯片，并将其放置在低温架上的架子上。
5. 用 OCT 盖住冷冻夹头，并将样品放在顶部。将萃取器柱塞降至样品上，使其平衡 3-5 分钟。
6. 将夹头安装到试样支架上，并将其定向，以便刀片可以直接穿过冷冻样品。将样品靠近刀片，使其面对粗糙。将厚度设置为 30 μm 并切片多个部分，直到生成均匀切割的切片。
7. 通过将截面厚度减小到 7-8 μm，切换到精细面。通过按切片上标记的玻璃幻灯片收集切片部分。将两张幻灯片放在每张幻灯片上，然后存放在幻灯片架上。允许在室温下干燥。
8. 干燥后，将滑轨架浸入 50% 乙醇中 3 分钟，以去除 OCT，使样品脱水。然后将机架转移到 80% 乙醇 3 分钟，然后将机架置于冷甲醇与丙酮的 1：1 比例下，在 -20°C 下放置 10 分钟。
9. 拆下滑轨架，将多余的溶剂排空纸巾上。20-30 分钟后，将幻灯片放入滑动盒中，并储存在 -20°C 的冰柜中，直到成像。

3. 使用 SEM 和 EDS 进行高分辨率成像

1. 按照"生物样品的SEM成像"中所述准备样品。然后，将样品加载到 SEM 中。
2. 打开 SEM，并将工作距离调整到 5 mm 左右，将加速电压和光束电流调整到 25 keV，对于生物样品来说，这通常过高。但是，样品被涂覆，用于导电和保护。
3. 开始成像并缩放至约 1，000-2，000 倍放大倍数，以查看包含纳米粒子的结构。请注意，如果没有反向散射检测 （BSD），则无法将其区分到特定深度以下。
4. 在相同的参数下插入 BSD，并将 z 方向的舞台移动到与之前相同的工作距离。
5. 以相同的放大倍率开始成像，并检查在纳米粒子存在的情况下，您能否看到高对比度。保存图像。
6. 使用不同的 BSD 配置（探测器上的电荷对齐）选择显示纳米粒子对比度最高的配置。
7. 放大显示纳米粒子或纳米粒子团的高对比度区域。
8. 打开造型室^的第2 个摄像头，通过按下 SEM 附件上的向下按钮，观察将 EDS 插入系统。一旦 EDS 靠近但未接触 BSD 或喷枪，松开按钮。
9. 打开EDS电脑（仍在工作站）上的Aztec程序，从SEM获取图像。 使用"点和拍摄"方法点击对比度和纳米粒子非常密集的区域。
10. EDS 将显示该点的特征 X 射线光谱。在图上查找要识别的钛峰。这证实了你所看到的确实是纳米粒子，而不是任何污染。
11. 返回样本并使用 Atlas 软件映射幻灯片上器官的边界。选择用于创建区域的镶嵌图像的"组织"协议，然后让它运行（这最多可能需要几个小时）。
12. 一旦软件创建并拼接复合图像，将其导出为 Tif 文件。
13. 在开源软件 ImageJ 中打开 Tif 文件，并调整对比度阈值以突出显示极高对比度的区域（即纳米粒子）。使用内置函数使用"器官"协议中定义的像素大小（应为 100 nm 左右）量化纳米粒子的体积。
14. 虽然此过程仅指小鼠肺的 1 周样本，但此过程与其他周和其他器官的样本一起重复，以编制显示分布的图表。
15. 在计算每个器官每周的生物分布情况后，生物分布图将显示8周内纳米粒子的生物分布和浓度的变化。这些显示了峰值浓度，也提供了纳米粒子从器官中清除需要多长时间的信息。