生长曲线:使用菌落成形单位和光学密度测量生成生长曲线

Overview

资料来源:安德鲁·范阿尔^斯特1，瑞安农M.勒^维克1，纳塔利娅·^马丁1，维克多·迪^丽塔1
¹密歇根州立大学微生物学和分子遗传学系，美国密歇根州东兰辛分校

生长曲线提供了有关细菌生长动力学和细胞生理学的宝贵信息。它们使我们能够确定细菌在可变生长条件下的反应，并为给定细菌定义最佳生长参数。原型增长曲线通过四个增长阶段前进:滞后、指数、静止和死亡（1）。

图1:细菌生长曲线。在批量培养中生长的细菌通过四个生长阶段:滞后、指数、静止和死亡。滞后期是细菌达到能够快速细胞生长和分裂的生理状态的时间段。指数阶段是细胞生长和分裂速度最快的阶段，在此期间，DNA复制、RNA转录和蛋白质生产均以恒定、快速的速度发生。固定阶段的特点是由于营养限制和/或有毒中间积累，细菌生长减慢和停滞。死亡期是细胞溶血由于严重营养限制而发生的阶段。

滞后期是细菌达到能够快速细胞生长和分裂的生理状态的时间段。出现这种滞后的原因是细菌需要时间来适应新的环境。一旦必要的细胞成分在滞后阶段产生，细菌进入指数增长阶段，DNA复制、RNA转录和蛋白质生产都发生

Procedure

1. 设置

所需的实验室材料:液体介质、凝固琼脂介质、Erlenmeyer烧瓶、15 mL试管、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、细菌细胞扩散器、70%乙醇和分光光度计。所有溶液和玻璃器皿在使用前都必须消毒。
使用 70% 乙醇进行消毒，为工作站做好准备。在 Bunsen 燃烧器附近工作，以防止介质污染。
使用细菌时，应使用适当的个人防护设备和无菌技术。使用细菌培养物时，需要实验室外套和手套。
缓冲剂、溶液和试剂的配方
1. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（8）。
2. 卢里亚-贝尔塔尼兄弟（LB）（9）。

2. 议定书

媒体准备
1. 识别生长介质，用于培养细菌，并在单独的可高压灭菌瓶中制备液体肉汤和固体琼脂（1.5% w/v琼脂）培养基。在这里，LB肉汤和LB琼脂为大肠杆菌的生长做好了准备。
2. 在设置为 121°C 的高压灭菌器中，用半紧固盖对介质进行消毒 35 分钟。
3. 对于琼脂介质，在高压灭菌后，放入设置为 50°C 的水浴中 30 分钟冷却。冷却后，将 20-25 mL 琼脂胶培养基倒入 100x15mm 圆形培养皿中。在使用前，让板在室温下设置24小时。
细菌的初始制备
1. 从冷冻库存中，条纹细菌在选定的介质琼脂上分离，以获得单菌群分离物。在允许为所选细菌生长条件下孵育。在这里，大肠杆菌在LB琼脂上条纹，在37°C过夜（16-18小时）孵育。
2. 使用无菌接种回路，从条纹板中选择单个菌落，在15 mL试管中接种4 mL液体介质，并在所选细菌允许的条件下生长。在这里，大肠杆菌在37°C下生长，在210rpm的转速下摇动过夜（16-18小时）。
增长曲线设置
1. 生长瓶制备
  1. 高压灭菌器适当大小埃伦迈耶烧瓶。通常使用 1:5 的介质与总烧瓶体积的比率。在这里，100 mL LB 介质用于 500 mL 烧瓶。
  2. 使用血清学移液器，将无菌介质转移到 Erlenmeyer 烧瓶。
2. 稀释系列制备
  1. 标签 15 mL 试管: -1， -2， -3， -4， -5， -6， -7， -8 和 -9，将 9mL PBS 分布到每个。这些数字对应于用于计算 CFU/mL 的稀释系数。每个收集时间点都需要一组新的管。（图2）
3. 阿加板制备
  1. 带有收集时间和稀释系数的标签板。对于每个时间点，每个稀释都有一个板。
增长曲线协议
1. 媒体接种
  1. 使用步骤 2.2.2 中准备的隔夜液体培养液，用 1:1000 容量的培养液为烧瓶介质接种。在这里，100 μL 隔夜液体培养剂添加到 100 mL LB 介质中。
  2. 旋转介质以均匀分布细菌。
2. 时点集合
  1. 生长条件设置
    1. 在为给定细菌选择的实验生长条件下放置烧瓶。对于快速生长的细菌，应经常使用时间点，对于生长缓慢的细菌，可以以较长的间隔进行。在这里，大肠杆菌在37°C下生长，以每分钟210转（rpm）摇动，每1小时采集一次时间点。
  2. 光学密度（OD600）测量
    1. 在每个时间点，包括起始时间点（t = 0），提取1 mL的细菌培养物，并分配到分光光度计比色皿中。
    2. 擦拭比色皿，并将光密度记录在 600 nm 波长。如果光学密度读数大于 1.0，则使用 900 μL 新介质稀释 100 μL 培养物 1:10，记录光学密度，并将此值乘以 10 进行 OD600 测量。
  3. 殖民地形成单元（CFU/mL）测量
    1. 在每个时间点，提取1 mL的细菌培养物，并放入含有9 mL PBS的-1玻璃试管中。
    2. 对于稀释系列，从 -1 管将 1 mL 从 -1 管向下所有稀释管转移到 -9，每次传输后涡旋。（图2）
    3. 对于每次稀释，将100 μL的细胞悬浮液分给相应标记的固体介质琼脂板。（图2）
    4. 使用在乙醇中灭菌、通过 Bunsen 燃烧器火焰并通过接触琼脂表面冷却的细胞扩张器，将 100 μL 的细胞悬浮液扩散，直到琼脂板表面变干。
    5. 在支持细菌生长的温度下倒置孵育扩散板。在这里，大肠杆菌在37°C孵育。
    6. 孵育后，一旦出现可见的菌落，计算每个板块上的细菌菌落数量，并记录这些值以及每个时间点所有板的相关稀释系数。

3. 数据分析和结果

光密度（OD600）增长曲线图
1. 在半对数尺度上绘制光学密度（OD600）与时间。（图3）
菌落形成单元（CFU/mL）生长曲线图
1. 对于每个时间点，选择菌落计数在 30-300 细菌范围内的稀释板。将菌群计数数乘以稀释系数，再乘以 10，因为 100 μL 差差在计算 CFU/mL 时被视为额外的 1:10 稀释。
2. 在半日志尺度上绘制殖民地形成单位与时间。（图4）
相关光学密度和菌落形成单元
1. 在小于或等于 1.0 OD600 的 OD600 读数的线性刻度上绘制菌落成形单元与光学密度，因为 OD600 和 CFU/mL 之间的关系在 1.0 OD600 之后的精确度较低。此处绘制了前六个时间点。（图5）
2. 生成显示方程和 R²值的线性回归趋势线。
确定细菌翻倍时间
1. 使用菌落形成单位生长曲线图，在指数相中，在图形上识别两个点，它们之间的斜率最陡，以计算倍增时间。
2. 计算加倍时间
  2. • 时间= t₂ - t₁，其中t₁ = 时间点 1 和t₂ = 时间点 2
  3. ，其中b = t₂的细菌数，B = t₁的细菌数，n = 代数的细菌数。派生自: .
  4. 使用:

Results

菌群形成单位和光学密度的图是可视化生长动力学的两种方法。通过确定 CFU/mL 和 OD600 之间的关系，光学密度图还提供了 CFU/mL 随时间的估计值。导致最短倍增时间的条件被认为是特定细菌生长的最佳条件。

Application and Summary

生长曲线对于了解细菌的生长动力学和生理学有价值。它们使我们能够确定细菌在可变生长条件下的反应，并为给定细菌定义最佳生长参数。菌落形成单位和光密度图都包含有价值的信息，描述了滞后阶段的持续时间，达到的最大细胞密度，并允许计算细菌倍增时间。生长曲线还允许在相同的生长条件下对不同细菌进行比较。此外，光学密度提供了一种标准化初始接种的方法，提高了其他实验中的一致性。

在设计增长曲线实验时，需要考虑使用哪种方法。作为生成生长曲线的首选方法，菌落形成单位图更准确地反映了批次培养中的可行细胞计数。菌落形成单位图还允许测量细菌生长的条件，否则会干扰光学密度测量。然而，这是一个更耗时的过程，需要广泛使用试剂，必须手动执行。光学密度图不太准确，仅提供菌落形成单位的估计值，需要为每个独特的细菌生成标准曲线。光学密度主要用于方便，因为它省时少，不需要很多试剂来工作。对光学密度最有吸引力的是，分光光度培养箱可以自动生成生长曲线，大大增加可立即测试的培养条件数量，并无需不断参与培养。

References

R. E. Buchanan. 1918. Life Phases in a Bacterial Culture. J Infect Dis 23:109-125.
CAMPBELL A. 1957. Synchronization of cell division. Bacteriol Rev 21:263-72.
Wang P, Robert L, Pelletier J, Dang WL, Taddei F, Wright A, Jun S. 2010. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol 20:1099-103.
Goldman E, Green LH. 2015. Practical Handbook of Microbiology, Third Edition. CRC Press.
Ben-David A, Davidson CE. 2014. Estimation method for serial dilution experiments. J Microbiol Methods 107:214-221.
Koch AL. 1968. Theory of the angular dependence of light scattered by bacteria and similar-sized biological objects. J Theor Biol 18:133-156.
Sezonov G, Joseleau-Petit D, D'Ari R. 2007. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol 189:8746-9.

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1. 设置

所需的实验室材料:液体介质、凝固琼脂介质、Erlenmeyer烧瓶、15 mL试管、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、细菌细胞扩散器、70%乙醇和分光光度计。所有溶液和玻璃器皿在使用前都必须消毒。
使用 70% 乙醇进行消毒，为工作站做好准备。在 Bunsen 燃烧器附近工作，以防止介质污染。
使用细菌时，应使用适当的个人防护设备和无菌技术。使用细菌培养物时，需要实验室外套和手套。
缓冲剂、溶液和试剂的配方
1. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（8）。
2. 卢里亚-贝尔塔尼兄弟（LB）（9）。

2. 议定书

媒体准备
1. 识别生长介质，用于培养细菌，并在单独的可高压灭菌瓶中制备液体肉汤和固体琼脂（1.5% w/v琼脂）培养基。在这里，LB肉汤和LB琼脂为大肠杆菌的生长做好了准备。
2. 在设置为 121°C 的高压灭菌器中，用半紧固盖对介质进行消毒 35 分钟。
3. 对于琼脂介质，在高压灭菌后，放入设置为 50°C 的水浴中 30 分钟冷却。冷却后，将 20-25 mL 琼脂胶培养基倒入 100x15mm 圆形培养皿中。在使用前，让板在室温下设置24小时。
细菌的初始制备
1. 从冷冻库存中，条纹细菌在选定的介质琼脂上分离，以获得单菌群分离物。在允许为所选细菌生长条件下孵育。在这里，大肠杆菌在LB琼脂上条纹，在37°C过夜（16-18小时）孵育。
2. 使用无菌接种回路，从条纹板中选择单个菌落，在15 mL试管中接种4 mL液体介质，并在所选细菌允许的条件下生长。在这里，大肠杆菌在37°C下生长，在210rpm的转速下摇动过夜（16-18小时）。
增长曲线设置
1. 生长瓶制备
  1. 高压灭菌器适当大小埃伦迈耶烧瓶。通常使用 1:5 的介质与总烧瓶体积的比率。在这里，100 mL LB 介质用于 500 mL 烧瓶。
  2. 使用血清学移液器，将无菌介质转移到 Erlenmeyer 烧瓶。
2. 稀释系列制备
  1. 标签 15 mL 试管: -1， -2， -3， -4， -5， -6， -7， -8 和 -9，将 9mL PBS 分布到每个。这些数字对应于用于计算 CFU/mL 的稀释系数。每个收集时间点都需要一组新的管。（图2）
3. 阿加板制备
  1. 带有收集时间和稀释系数的标签板。对于每个时间点，每个稀释都有一个板。
增长曲线协议
1. 媒体接种
  1. 使用步骤 2.2.2 中准备的隔夜液体培养液，用 1:1000 容量的培养液为烧瓶介质接种。在这里，100 μL 隔夜液体培养剂添加到 100 mL LB 介质中。
  2. 旋转介质以均匀分布细菌。
2. 时点集合
  1. 生长条件设置
    1. 在为给定细菌选择的实验生长条件下放置烧瓶。对于快速生长的细菌，应经常使用时间点，对于生长缓慢的细菌，可以以较长的间隔进行。在这里，大肠杆菌在37°C下生长，以每分钟210转（rpm）摇动，每1小时采集一次时间点。
  2. 光学密度（OD600）测量
    1. 在每个时间点，包括起始时间点（t = 0），提取1 mL的细菌培养物，并分配到分光光度计比色皿中。
    2. 擦拭比色皿，并将光密度记录在 600 nm 波长。如果光学密度读数大于 1.0，则使用 900 μL 新介质稀释 100 μL 培养物 1:10，记录光学密度，并将此值乘以 10 进行 OD600 测量。
  3. 殖民地形成单元（CFU/mL）测量
    1. 在每个时间点，提取1 mL的细菌培养物，并放入含有9 mL PBS的-1玻璃试管中。
    2. 对于稀释系列，从 -1 管将 1 mL 从 -1 管向下所有稀释管转移到 -9，每次传输后涡旋。（图2）
    3. 对于每次稀释，将100 μL的细胞悬浮液分给相应标记的固体介质琼脂板。（图2）
    4. 使用在乙醇中灭菌、通过 Bunsen 燃烧器火焰并通过接触琼脂表面冷却的细胞扩张器，将 100 μL 的细胞悬浮液扩散，直到琼脂板表面变干。
    5. 在支持细菌生长的温度下倒置孵育扩散板。在这里，大肠杆菌在37°C孵育。
    6. 孵育后，一旦出现可见的菌落，计算每个板块上的细菌菌落数量，并记录这些值以及每个时间点所有板的相关稀释系数。

3. 数据分析和结果

光密度（OD600）增长曲线图
1. 在半对数尺度上绘制光学密度（OD600）与时间。（图3）
菌落形成单元（CFU/mL）生长曲线图
1. 对于每个时间点，选择菌落计数在 30-300 细菌范围内的稀释板。将菌群计数数乘以稀释系数，再乘以 10，因为 100 μL 差差在计算 CFU/mL 时被视为额外的 1:10 稀释。
2. 在半日志尺度上绘制殖民地形成单位与时间。（图4）
相关光学密度和菌落形成单元
1. 在小于或等于 1.0 OD600 的 OD600 读数的线性刻度上绘制菌落成形单元与光学密度，因为 OD600 和 CFU/mL 之间的关系在 1.0 OD600 之后的精确度较低。此处绘制了前六个时间点。（图5）
2. 生成显示方程和 R²值的线性回归趋势线。
确定细菌翻倍时间
1. 使用菌落形成单位生长曲线图，在指数相中，在图形上识别两个点，它们之间的斜率最陡，以计算倍增时间。
2. 计算加倍时间
  2. • 时间= t₂ - t₁，其中t₁ = 时间点 1 和t₂ = 时间点 2
  3. ，其中b = t₂的细菌数，B = t₁的细菌数，n = 代数的细菌数。派生自: .
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Data Analysis and Results

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