生长曲线:使用菌落成形单位和光学密度测量生成生长曲线

1. 设置

1. 所需的实验室材料:液体介质、凝固琼脂介质、Erlenmeyer烧瓶、15 mL试管、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、细菌细胞扩散器、70%乙醇和分光光度计。所有溶液和玻璃器皿在使用前都必须消毒。
2. 使用 70% 乙醇进行消毒，为工作站做好准备。在 Bunsen 燃烧器附近工作，以防止介质污染。
3. 使用细菌时，应使用适当的个人防护设备和无菌技术。使用细菌培养物时，需要实验室外套和手套。
4. 缓冲剂、溶液和试剂的配方
   1. 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （8）。
   2. 卢里亚-贝尔塔尼兄弟 （LB） （9）。

2. 议定书

1. 媒体准备
   1. 识别生长介质，用于培养细菌，并在单独的可高压灭菌瓶中制备液体肉汤和固体琼脂（1.5% w/v琼脂）培养基。在这里，LB肉汤和LB琼脂为大肠杆菌的生长做好了准备。
   2. 在设置为 121°C 的高压灭菌器中，用半紧固盖对介质进行消毒 35 分钟。
   3. 对于琼脂介质，在高压灭菌后，放入设置为 50°C 的水浴中 30 分钟冷却。冷却后，将 20-25 mL 琼脂胶培养基倒入 100x15mm 圆形培养皿中。在使用前，让板在室温下设置24小时。
2. 细菌的初始制备
   1. 从冷冻库存中，条纹细菌在选定的介质琼脂上分离，以获得单菌群分离物。在允许为所选细菌生长条件下孵育。在这里，大肠杆菌在LB琼脂上条纹，在37°C过夜（16-18小时）孵育。
   2. 使用无菌接种回路，从条纹板中选择单个菌落，在15 mL试管中接种4 mL液体介质，并在所选细菌允许的条件下生长。在这里，大肠杆菌在37°C下生长，在210rpm的转速下摇动过夜（16-18小时）。
3. 增长曲线设置
   1. 生长瓶制备
      1. 高压灭菌器适当大小埃伦迈耶烧瓶。通常使用 1:5 的介质与总烧瓶体积的比率。在这里，100 mL LB 介质用于 500 mL 烧瓶。
      2. 使用血清学移液器，将无菌介质转移到 Erlenmeyer 烧瓶。
   2. 稀释系列制备
      1. 标签 15 mL 试管: -1， -2， -3， -4， -5， -6， -7， -8 和 -9， 将 9mL PBS 分布到每个。这些数字对应于用于计算 CFU/mL 的稀释系数。每个收集时间点都需要一组新的管。（图2）
   3. 阿加板制备
      1. 带有收集时间和稀释系数的标签板。对于每个时间点，每个稀释都有一个板。
4. 增长曲线协议
   1. 媒体接种
      1. 使用步骤 2.2.2 中准备的隔夜液体培养液，用 1:1000 容量的培养液为烧瓶介质接种。在这里，100 μL 隔夜液体培养剂添加到 100 mL LB 介质中。
      2. 旋转介质以均匀分布细菌。
   2. 时点集合
      1. 生长条件设置
         1. 在为给定细菌选择的实验生长条件下放置烧瓶。对于快速生长的细菌，应经常使用时间点，对于生长缓慢的细菌，可以以较长的间隔进行。在这里，大肠杆菌在37°C下生长，以每分钟210转（rpm）摇动，每1小时采集一次时间点。
      2. 光学密度 （OD600） 测量
         1. 在每个时间点，包括起始时间点（t = 0），提取1 mL的细菌培养物，并分配到分光光度计比色皿中。
         2. 擦拭比色皿，并将光密度记录在 600 nm 波长。如果光学密度读数大于 1.0，则使用 900 μL 新介质稀释 100 μL 培养物 1:10，记录光学密度，并将此值乘以 10 进行 OD600 测量。
      3. 殖民地形成单元 （CFU/mL） 测量
         1. 在每个时间点，提取1 mL的细菌培养物，并放入含有9 mL PBS的-1玻璃试管中。
         2. 对于稀释系列，从 -1 管将 1 mL 从 -1 管向下所有稀释管转移到 -9，每次传输后涡旋。（图2）
         3. 对于每次稀释，将100 μL的细胞悬浮液分给相应标记的固体介质琼脂板。（图2）
         4. 使用在乙醇中灭菌、通过 Bunsen 燃烧器火焰并通过接触琼脂表面冷却的细胞扩张器，将 100 μL 的细胞悬浮液扩散，直到琼脂板表面变干。
         5. 在支持细菌生长的温度下倒置孵育扩散板。在这里，大肠杆菌在37°C孵育。
         6. 孵育后，一旦出现可见的菌落，计算每个板块上的细菌菌落数量，并记录这些值以及每个时间点所有板的相关稀释系数。

3. 数据分析和结果

1. 光密度 （OD600） 增长曲线图
   1. 在半对数尺度上绘制光学密度 （OD600） 与时间。（图3）
2. 菌落形成单元 （CFU/mL） 生长曲线图
   1. 对于每个时间点，选择菌落计数在 30-300 细菌范围内的稀释板。将菌群计数数乘以稀释系数，再乘以 10，因为 100 μL 差差在计算 CFU/mL 时被视为额外的 1:10 稀释。
      
   2. 在半日志尺度上绘制殖民地形成单位与时间。（图4）
3. 相关光学密度和菌落形成单元
   1. 在小于或等于 1.0 OD600 的 OD600 读数的线性刻度上绘制菌落成形单元与光学密度，因为 OD600 和 CFU/mL 之间的关系在 1.0 OD600 之后的精确度较低。此处绘制了前六个时间点。（图5）
   2. 生成显示方程和 R²值的线性回归趋势线。
4. 确定细菌翻倍时间
   1. 使用菌落形成单位生长曲线图，在指数相中，在图形上识别两个点，它们之间的斜率最陡，以计算倍增时间。
   2. 计算加倍时间
      1. 
      2. • 时间= t₂ - t₁，其中t₁ = 时间点 1 和t₂ = 时间点 2
      3. ，其中b = t₂的细菌数，B = t₁的细菌数，n = 代数的细菌数。 派生自: .
      4. 使用: