1. 爱普国际测度测试（电子测试）

1. 设置
   1. 戴上手套和实验室外套
   2. 使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒，为工作空间做好准备
   3. 收集穆勒-欣顿琼脂板（MHA板）
2. 准备麦克法兰浊度标准 0.5
   1. 制备1%的氯化铵溶液（BaCl₂）：
      在100 mL蒸馏水中加入1克无水氯化物（BaCl_2）。漩涡井。
   2. 制备1%的硫酸溶液（H₂SO₄）：
      在99 mL蒸馏水中加入1 mL的浓缩H₂SO_4。漩涡井。
   3. 准备麦克法兰浊度标准 0.5 号：
      50 μL BaCl₂溶液，5 mL 1% H₂SO₄溶液。涡旋溶液好，以获得浑浊的悬浮液。
   4. 将麦克法兰浊度标准 0.5 号保存在铝箔覆盖的管子中。在 25°C 下存放最多 6 个月。涡旋井到同质溶液使用前。
3. 准备 MHA 板
   1. 使用无菌循环从血琼脂板中刮取链球菌组 G 细菌。混合成1mL的盐水，涡旋到暂停的细菌。
   2. 将悬架与麦克法兰标准0.5进行比较，以获得相同的浊度，以便在实验过程中具有相同的接种尺寸。使用额外的盐水或细菌调节浓度。
   3. 使用无菌棉倒施用器为 MHA 板接种。轻轻涂抹板以覆盖表面。继续执行下面描述的三种方法之一 （1.4-1.6）。
4. 单一抗生素耐药性测试。 链球菌组 G，对青霉素 G 或根霉素的抗药性
   1. 在 MHA 板的中心放置一个电子测试条（青霉素 G 或金霉素）（图1 A，B）。
   2. 孵育18-20小时，37°C。
   3. 阅读结果。MIC 被测量为与分级抗生素测试条相交的抑制区（图 1 C，D）。

图1：单电子测试。将E-测试条A）青霉素G和B）根霉素放在穆勒Hinton琼脂板上，在（A和B）和后（C和D）过夜，覆盖着G链球菌群的细菌菌落在37°C 5% CO_2孵育。请点击此处查看此图的较大版本。

5. 协同测试交叉方法。链球菌组G，对青霉素G和根霉素的抗药性。
   1. 将两个带有不同抗生素（如青霉素 G 和根霉素）的 E 测试条置于接种的 MHA 板上，形成交叉形式。
      1. 为了获得最准确的结果，目标是将十字以大约 90° 角放置在刻度之间的交点处，其 MIC 值以前在单个抗生素耐药性测试中确定（图 2 A）。
      2. 请注意，一旦条被放置在琼脂板上，它们就不应该移动，因为某些抗生素可能已经被板吸收。因此，将条带保持在稍微错误的角度（例如 85°）和实际 MIC 值高达 1-2 mm 时更为合适。建议在三元运行实验以减少此问题。
   2. 孵育18-20小时，37°C。
   3. 阅读结果。MIC 被测量为与每个电子测试条上分级抗生素测试条相交的抑制区（图 2 B）。
   4. 使用分数抑制浓度 （FIC） （ 方程1） 的公式来确定协同效应。

图2：协同检测 - 交叉测试。青霉素G和文母素MIC在链球菌组（A）和后（B）在37°C 5%CO₂孵育过夜的结果。在两个单独的 MIC 值之间形成 90° 角（青霉素 G： 0.094 μg/mL，绅士素：8 μg/mL）。请点击此处查看此图的较大版本。

6. 协同测试非交叉方法。链球菌组G，对青霉素G和根霉素的抗药性。
   1. 将电子测试条置于 MHA 板的中心（图 3 A，D）。
   2. 标记以前确定的每个条带上的 MIC 值的位置。
   3. 在室温下孵育1小时。
   4. 丢弃每个 MHA 板的 E 测试条 （图 3 B，E）。
   5. 将第二个电子测试条（包含不同的抗生素）分别放在先前移除的带子的面积上，以便其 MIC 值与标记相对应并对齐。
   6. 孵育18-20小时，37°C。
   7. 阅读结果。MIC 被测量为与每个电子测试条上分级抗生素测试条相交的抑制区（图 3 C，F）。
   8. 为了确定协同效应，使用分数抑制浓度 （FIC） 公式 （公式 1）。

图3：协同检测- 非交叉测试。在链球菌组G.A）根他霉素带（8微克/毫升居中）的链球菌组G细菌上，青霉素G和文母素的MIC抗菌协同试验结果，B）去除根霉素带，C）联合根霉素 / 青霉素 G 条 （0.094 μg/mL 居中）在链球菌组 G 细菌的顶部， D）青霉素 G 条 （0.094 μg/mL 居中）， E）去除青霉素 G 条， F）联合青霉素 G /在链球菌群G细菌顶部的根霉菌带（8微克/毫升居中）。请点击此处查看此图的较大版本。

2. 兄弟测试

1. 设置
   1. 戴上手套和实验室外套
   2. 使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒，为工作空间做好准备
   3. 收集15mL MH汤与50%裂裂马血和20毫克/mL +-NAD （MH-F）
2. （可选）执行电子测试 [协议 1] 以确定固体介质上的 MIC
   1. 虽然是可选的，但此类知识将允许更好的实验设计（例如，添加的抗生素的浓度可以设计为围绕从板中确定的 MIC 值），从而增加成功实验的机会。
3. 准备细菌接种。如上所述，细菌浓度可以通过 OD nm 测量或麦克法兰浊度标准进行估计
   1. OD600 nm 方法
      1. 获得具有既定细菌浓度的细菌悬浮液
      2. 稀释 MH-F 肉汤中的培养，以达到 0.003 的 OD600
   2. 麦克法兰浊度法
      1. 将 15 mL MH-F 汤放入无菌管中。
      2. 用细菌（从盘子）接种MH-F肉汤到麦克法兰水平。大力涡旋溶液。将溶液倒入无菌培养皿中。
4. 准备抗生素
   1. 确定所需的抗生素浓度
      1. 从 E-测试中识别 MIC 值（例如，青霉素 G 为 0.125 μg/mL，而金素为 8 μg/mL）
      2. 将琼脂板MIC值乘以2^4-27，对应四-七 2x连续稀释。这将是抗生素的起始浓度。（例如，对于青霉素 G，7 个 2x 串行稀释：0.125 μg/mL x 2⁷ = 16 μg/mL;对于温西霉素，四个 2x 串行稀释 8 μg/mL x 2⁴ = 128 μg/mL
      3. 乘以所需的起始值100倍，以确定抗生素的库存浓度（例如1.6毫克/毫克青霉素G和12.8毫克/mL甘他素的库存）
   2. 相应地制备100倍抗生素库存浓度
      1. 溶解抗生素在10mL灭菌水中，并涡旋产生库存溶液（例如16毫克青霉素G和128毫克gentamicin，以创造上述库存）
5. 将细菌添加到微孔
   1. 在96孔微针板的前3排的井中，含有细菌接种的Aliquote 200μl MH-F肉汤，用于三联实验。
6. 在微孔中添加抗生素
   1. 将含有细菌的额外 MH-F 肉汤添加到第一列井（A1、B1、C1）中，使总体积达到 400 μL。
   2. 将4μL的抗生素浓度添加到第一列油井中。由于样品含有400μL，它将导致抗生素稀释100倍。
   3. 通过将 200 μL 细菌/抗生素从 A1 转移到 A2，一直转移到 A11，从而产生 2 倍的连续稀释。在稀释物之间大力移位。对其他行重复此步骤。
   4. 从 11 柱中取出 200 μL，使所有井中的最终体积为 200 μL。
   5. 将最后一列（A12、B12、C12）不带抗生素作为对照。
7. 确定 MIC 值
   1. 在 37°C 下孵育 96 孔微小奶嘴板 24 小时，不发抖。
   2. MIC值被定义为稀释系列中最后一口没有明显细菌生长的井（图4）。但是，只有当原始接种大小正确时，才能信任此值。

图4：由肉汤稀释测定MIC。MIC被定义为在改变浊度之前表现出清晰（细菌没有生长）的最后一口井。行是青霉素 G 的 MIC 值的重复项，行是 gentamicin 的 MIC 值的重复项，与链球菌组 G. A 的隔离物相比，B） 对 A （a） 值的示意图解释灰色 = 无增长;白色 = 增长）。请点击此处查看此图的较大版本。

图5：稀释序列的原理法法，以计算原细菌浓度。稀释液以所述方式执行（10x 稀释系列在 180 μL 中稀释 20 μL），然后 A-H 行中的 10 μL 被如所示在两个单独的血琼脂板上镀。请点击此处查看此图的较大版本。

8. 确定原始接种大小
   注：Microbroth 测定法对使用的原始接种尺寸非常敏感。过量的接种量会产生假阳性结果，因为添加的抗生素将无法以该比例抑制生长。因此，验证微井中添加了多少细菌至关重要。虽然数据在实验点不可用（由于需要24小时孵育），但它将作为控制。如果添加的细菌数量在规定的浓度范围内，则 MIC 值是可信的。如果接种过高或过低，则需要重复实验。
   1. 连续稀释细菌
      1. 准备一个96孔微蒂剂板来稀释原来的细菌浓度，以确定接种大小。最佳体积为 200 μL，含有 10^5-6种细菌。要执行稀释，首先对 B-H 中每个井（三联体 1-3）中的每个井进行等分 180 μL 无菌 PBS。
      2. 接下来，将100μl的细菌溶液加入A（三联体1-3）。
      3. 通过将 20 μl 细菌从 A 转移到 B，大力移液，生成 10 倍连续稀释（以三联苯为单位）。重复 C-H 的步骤。
   2. 板细菌稀释剂，用于确定接种大小
      1. 根据图5标记血琼脂板。
      2. 根据图5将10μL从串行稀释转移到板。
      3. 在 37°C 下孵育板 20-24 小时。
   3. 确定细菌接种大小
      1. 计算5-50个菌落内的点细菌数量（图6）。
      2. 通过计算三联体样品的平均值，乘以稀释系数（例如，B样品的10倍，C样品的100倍，D样品的1000x等），再乘100，以补偿10μL的斑点体积，从而得出以 cfu/mL 表示的接种量。如果接种量在 10^5-6 cfu/mL 内，则可以信任 MIC 数据。

图 6：确定接种量。根据图5接种的细菌在37°C下孵育20-24小时，然后计数。D行有大量殖民地需要计数（例如 5-50）。A 中的样品未稀释，B 稀释 10x，C 稀释 100x，D 稀释 1000x，每个点仅镀 10 μL。请点击此处查看此图的较大版本。