此方法可以帮助回答宿主-病原体相互作用领域的关键问题，例如，高效感染细胞的独特特征是什么，宿主辅助因子允许病毒建立生产性感染，以及如何在治疗干预中针对这些细胞。该技术的主要优点是，它为单细胞内的蛋白质和mRNA提供定量测量，而且大多数试剂都是市售的。演示细胞分拣程序将是马修·克里根，一个高级技术员从流动细胞学核心在医生迈克尔·埃勒的实验室。
首先，在指定的PCR前分子生物学工作站中，通过将96个基因表达检测组合成RNase、DNase自由管来准备检测组合，确保将每个测定添加到180纳米摩尔的正向和反向底转的最终浓度中。添加DNA悬浮液缓冲液，实现测定混合物的适当稀释。对于每个预期的 96 由 96 芯片阵列，移液器每个检测的 6 微升到 96 井 PCR 板的指定井中，然后用粘合剂密封板。
要开始表面染色可行的细胞，在组织培养生物安全柜中，首先准备补偿样品和荧光抗体鸡尾酒的主混合物，如文本协议中所述。在37摄氏度的水浴中解冻冷冻细胞两分钟。在此之后，将5至2毫升的细胞悬浮液加入含有12毫升PBS的15毫升管中。
在 500 G 下在 25 摄氏度下离心 3 分钟，然后吸气 PBS，然后用三毫升新鲜 PBS 将颗粒重新暂停。将这种混合物转移到五毫升聚苯乙烯管中。在25摄氏度下再次在500G下离心3分钟。
吸升液，留下约10微升残余PBS。接下来，在80微升抗体鸡尾酒中重新增殖多达2000万个洗涤细胞。在25摄氏度下孵育20分钟，同时防止光线。
在此之后，添加三毫升的 PBS。在500G下离心3分钟，吸上一代。在 300 到 500 微升 PBS 中彻底重新暂停细胞。
通过 35 微米尼龙电池过滤器盖进行移液过滤此溶液。然后把细胞放在冰上， 防止光线， 直到排序。回到 PCR 前工作站，首先在单个 RNase、无 DNase 无菌管中准备 RT 预置反应混合物，如文本协议中所述。
使用多通道移液器，将 10 微升这种反应混合到所需的 96 孔 PCR 排序收集板中。用胶粘膜密封板，然后将板放在预冷却的 96 井铝块上。在此之后，建立细胞分拣门控方案，并准备文本协议中概述的流动细胞计量细胞分拣器。
输入适当的仪器设置，指定要排序到每个井中的单元格的数量和子集。拆下胶粘剂密封，然后 FACS 将电池分拣到准备好的 96 孔 PCR 收集板中。用新鲜的胶粘膜重新密封板。
立即旋转重新密封的板，然后在2000 G下在4摄氏度下离心1分钟。在 PCR 机器中热循环板，在 50 摄氏度下预热盖子 15 分钟，然后加热 95 摄氏度 2 分钟。最后，热循环18个周期95摄氏度，15秒60摄氏度4分钟，然后在PCR后工作站，将5微升cDNA转移到20微升DNA悬浮缓冲液中，在一个新的96井PCR板中。
首先，通过在每一井中移液四微升的测定加载试剂来准备 qPCR 检测板。接下来，将每个测定的四微升从 2X 检测板转移到 qPCR 板。将 qPCR 检测板保持在 4 摄氏度。
将控制管路液体从吸油注射器分配到芯片的两个进气阀中。从板下取下保护塑料。将芯片放在 IFC 控制器上，将刻口侧放在 A1 位置，然后选择并运行主脚本。
对于每个微流体芯片，将样品加载试剂的 50 微升与 500 微升的 PCR 主混合混合，以准备实时反应组合。这种反应的移液器 4.4 微升混合到新的 96 井 PCR 板的每个井中，现在指定为样品板。接下来，移液器3.6微升的先前稀释的cDNA进入样品板的每个井。
在此之后，将五微升从检测板转移到芯片的切头侧的相应井。将样品板中的五微升转移到芯片另一侧的相应井中。将加载的芯片插入 IFC 控制器并运行负载混合脚本。
接下来，将芯片传输到 BioMark 平台，并设置文本协议中概述的仪器，然后将芯片运行文件保存在指定的文件夹中。芯片运行完成后，打开实时PCR分析软件，然后选择文件，打开，打开芯片运行。bml 文件。
在软件窗口的左上角，定位芯片资源管理器和芯片运行摘要。在芯片运行摘要下，单击探测器设置。在"任务"下，单击"新"并选择容器类型 SBS 板和容器格式 SBS 96。
单击映射旁边的省略号按钮，然后选择 M96-Assay-SBS96.dsp。单击分析视图。在任务下的 qPCR 选项卡中，为用户探测器选择线性导数和 CT 阈值方法的基线校正。
在 CT 阈值选项卡中，使用自动框检查初始化，然后单击分析按钮。在分析视图的右上象限中，单击第二个选项卡结果表。从下拉菜单中，选择热图视图，将显示包含数据的热图。
在热图下，单击阈值和日志图。通过单击由热图上的列表示的测定，并根据需要拖动阈值以与指数相中的放大曲线相交，手动调整每个检测器的 CT 阈值。完成后，单击"分析"。
接下来，将 qPCR 数据导出为 csv 文件。将 qPCR 数据从 BioMark 计算机传输到桌面。将数据导入电子表格或统计分析软件，并按芯片上的样本和分析位置绘制结果图。
创建一个新列，并使用条件公式根据病毒基因的表达将细胞组织成组。在分析下，选择适合Y X 和绘制基因表达与组。在此之后，使用 FlowJo 版本 9 打开来自 FACS 的 FCS 文件，这些文件排序对应于 96 井板。
突出显示文件名后，选择平台、事件编号门，并创建索引排序门。单个单元格将显示为行。突出显示所有 96 个单元格，然后选择工作区、导出、选择所有补偿楼层。
在"数据"下，选择 FCS 文件，单击"导出"，然后选择指定文件夹。将单个单元格的新 FCS 文件拖入新的 FlowJo 工作区。突出显示所有单元格并单击添加统计信息，由西格玛按钮、均值和所有荧光参数表示。
打开表编辑器，然后突出显示第一个单元格的所有楼层，并将其拖动到表编辑器窗口中。在此窗口中，单击"创建和查看表"。在此之后，通过复制粘贴或单击保存和启动应用程序按钮，复制并输出到统计软件中。
将单单元 FACS 数据与 JMP 中的 qPCR 数据（按板号和井位置）合并。最后，对组合数据进行图形化和统计分析。本研究通过多参数流式细胞学进行单细胞表面蛋白质定量，通过高多路复用RTqPCR与定量单细胞mRNA表达进行整合。
这里显示的是单细胞定量病毒基因表达从FACS排序的Rhus猴CD4阳性T细胞。阴性细胞的Tat/rev阳性N比深绿色阳性细胞的N份少，这与稳定前的早期感染和部分拼接病毒RNA的核出口一致。在阳性细胞的tat/rev阳性N中，大量未复制的Gag-RNA与晚期生产性感染一致，在此期间，丰富的基因组RNA被表达并包装成萌芽的病毒。
显示单细胞病毒基因、宿主基因和宿主表面蛋白表达的三变量图显示，即使CD4和CD3转录保持，表面CD4和CD3蛋白表达在绿色显示的tat/rev阳性细胞中也减少。一旦掌握了，这项技术可以在两到三天内完成。看完这段视频后，您应该对如何进行有针对性的单细胞原体评估有一个良好的理解，以解决与病毒感染细胞中的不同表达基因和蛋白质有关的问题。
