首先，关闭房间灯。在 FlowView 软件的眼部面板下选择眼部。将立方体转塔更改为四个TRITC，并在软件中触摸屏控制器的背光下单击关闭触摸面板控制器。
然后关闭计算机屏幕。打开显微镜上黑布盖的正面。从黑匣子中取出装有胚胎的35毫米玻璃底培养皿，并将其放在显微镜载物台上。
然后打开荧光照明装置，并使用目镜识别感兴趣的胚胎。聚焦它。关闭黑布盖以保护样品免受光照。
打开计算机屏幕以访问控制显微镜的软件。在软件中将眼睛更改为LSM以进行图像采集。使用25倍放大的水浸物镜在对照未受刺激的胚胎中进行激光消融。
从工具窗口中单击“亮 Z”、“序列管理器”和“LSM 刺激”。将扫描仪类型设置为 Galvano，将扫描大小设置为 512 x 512。打开PMT设置面板下的通道一和通道三，以允许使用1040纳米激光器，然后单击实时四倍速度以可视化胚胎。
使用旋转功能旋转胚胎，使前后轴垂直定向，并将缩放设置为三。使用扫描设置下的形状工具绘制感兴趣区域或 ROI，然后在参考面板中设置 ROI 大小。接下来，将 ROI 设置为宽度为 512 像素，高度为 100 像素。
要设置消融前 Z 堆栈的采集参数，请在 Z 部分下将胚胎表面注册为零。将起点设置为零，将终点设置为 100 微米。将步长设置为两微米，并通过选中系列选项卡下的Z来激活Z采集模式。
使用明亮的 Z 函数，将 1040 纳米激光强度设置为线性增加，从 3% 增加到 7%通过单击序列管理器中的 LSM 将当前成像设置保存为管道的第一个任务。要为消融前视频设置采集参数，如前所述，在胚胎腹面附近设置512 x 512像素的ROI。将 1， 040 纳米激光强度设置为 3%检查时间，并取消选中串联面板下的 Z。
在延时摄影面板下将间隔保留为自由运行，并将周期设置为 10。通过单击序列管理器中的 LSM，将当前设置另存为管道的下一个任务。要设置激光烧蚀的参数，请定义紧邻卵黄膜下方的 3D 区域。
将 Z 堆栈的起点设置为平面，将终点设置为深度 20 微米。将步长设置为 1.5 微米。打开PMT设置面板下的通道二和通道四，以允许使用920纳米激光器。
将激光强度设置为 30%，并在定义的 3D 区域内使用激光为单个 Z 堆栈设置图像采集。通过单击序列管理器中的 LSM，将当前设置另存为管道的下一个任务。要设置消融后影片的采集参数，请使用 1、040 和 920 纳米激光器为 100 帧单 Z 平面消融后短片设置图像采集。
将激光强度设置为 3% 和 0.3%通过单击序列管理器中的 LSM 将当前设置保存为管道的下一个任务。在“获取”下选择序列。根据需要更改数据保存路径和文件名。
单击就绪，等待软件初始化管道，然后单击启动以执行管道。要在受刺激的胚胎中进行激光消融，请为未受刺激的胚胎设置消融前Z堆栈的采集参数。通过单击序列管理器中的 LSM，将当前设置另存为管道的第一个任务。
要在定义的ROI内设置光遗传学刺激的参数，请将缩放更改为1，然后选择覆盖胚胎腹侧表面的ROI。关闭通道 1 到通道 4 检测器，单击 LSM 刺激，取消选中持续时间内的连续，然后键入 12 秒。通过单击序列管理器中的刺激，将当前设置另存为管道的下一个任务。
在刺激后设置三分钟的等待时间，以确保肌球蛋白完全失活和顶端F-肌动蛋白拆卸，并在激光消融前实现静态组织形态。接下来，为单个Z平面预消融视频设置采集参数，如未受刺激胚胎所示，除了1,040和920纳米激光器用于图像采集。打开通道一以通道四探测器。
将激光强度设置为 3% 和 0.3%通过单击序列管理器中的 LSM 将当前设置保存为管道的下一个任务。设置激光消融的参数，如未受刺激的胚胎所示。通过单击序列管理器中的 LSM，将当前设置另存为管道的下一个任务。
为单个Z平面消融后视频设置采集参数，如未刺激胚胎所示。通过单击序列管理器中的 LSM，将当前设置另存为管道的下一个任务。在“获取”下选择序列。
根据需要更改数据保存路径和文件名。单击就绪并等待软件初始化管道，然后单击开始以执行管道。在经历顶端收缩的未刺激胚胎中，意大利面南瓜mCherry在内侧顶端区域富集，而CRY2Rho一个显性的阴性mCherry是细胞质的。
在受刺激的胚胎中，CRY2Rho一个显性的负mCherry信号成为质膜定位，而意大利面南瓜mCherry的内侧顶端信号完全消失。在收缩域内对未受刺激的胚胎进行激光消融导致沿前后轴的快速组织后坐力，而在受刺激的胚胎中进行激光消融不会导致明显的组织后坐力。消融被量化并显示在这里。
