저자는 이미징 지원에 대해 Ann Lavanway에게 감사를 표합니다. 저자들은 시약을 공유해 준 Wieschaus 연구실과 De Renzis 연구실에, 플라이 스톡에 대해 Bloomington Drosophila Stock Center에 감사를 표합니다. 이 연구는 NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 및 미국 암 학회 기관 연구 보조금 #IRG-82-003-33에 의해 BH에 지원됩니다.

초파리에서 Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제

저자는 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.

이 프로토콜은 악토미오신 수축성이 비활성화된 직후 조직 장력의 변화를 조사하기 위해 광유전학과 레이저 절제의 병용을 설명했습니다. 여기에 설명된 광유전학적 도구는 Rho1(Rho1DN)의 지배적인 음성 형태를 이용하여 내인성 Rho1 및 Rho1 의존성 악토미오신 수축성을 급격히 억제합니다. 초파리 복부 고랑 형성의 맥락에서 Opto-Rho1DN의 이전 특성화는 이 도구가 동시 미오신 불활성화 및 액틴 ...

액토미오신 수축성(actomyosin contractility)은 F-액틴 네트워크에서 비근육 미오신 II(이하 '미오신')에 의해 가해지는 수축력으로, 세포 형태를 변화시키고 조직 수준의 형태 형성을 유도하는 가장 중요한 힘 중 하나이다 1,2. 예를 들어, 상피 세포의 정점 도메인에서 악토미오신 수축성의 활성화는 정단 수축을 초래하며, 이는 상피 접힘, 세포 압출, 박리 및 상처 치유를 포함한 다양한 형태 형성 과정을 촉진합니다 3,4,5,6,7 . 미오신의 활성화는 그의 조절 경쇄의 인산화를 필요로 한다. 이 변형은 미오신 분자의 억제 형태를 완화하여 양쪽 끝에 여러 헤드 도메인이 있는 양극성 미오신 필라멘트 다발을 형성할 수 있도록 합니다. 양극성 미오신 필라멘트는 액틴 필라멘트의 역평행 운동을 유도하고 수축력 1,8,9를 생성합니다.
진화적으로 보존된 Rho 계열의 작은 GTPase RhoA(초파리의 Rho1)는 다양한 세포 맥락에서 악토미오신 수축성의 활성화에 중심적인 역할을 한다10,11. Rho1은 GTP(활성형) 또는 GDP(비활성형)12에 결합하여 이분자 스위치로 기능합니다. GTP 또는 GDP 결합 Rho1 사이의 순환은 GTPase 활성화 단백질(GAP)과 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)에 의해 조절됩니다13. GEF는 GTP에 대한 GDP의 교환을 촉진하여 Rho1 활성을 활성화하는 기능을 합니다. 반면에 GAP는 Rho1의 GTPase 활성을 향상시켜 Rho1을 비활성화합니다. 활성화된 Rho1은 다운스트림 이펙터인 Rho 관련 키나아제(Rok) 및 Diaphanous14와 상호 작용하고 활성화하여 악토미오신 수축성을 촉진합니다. Rok은 미오신15의 조절 경쇄를 인산화하여 미오신 활성화 및 악토미오신 수축성을 유도한다. 또한, Rok은 또한 미오신 조절 경쇄 포스파타제를 억제하고, 따라서 미오신 필라멘트 조립을 더욱 촉진한다16. Rok은 또한 LIM 키나아제를 인산화할 수 있으며, 이는 활성화될 때 액틴-해중합 인자인 코필린(17,18)을 인산화 및 억제함으로써 액틴 분해를 방지합니다. Diaphanous는 액틴 중합을 촉진하는 포르민 계열 액틴 핵제로, 미오신이 19,20,21과 상호 작용할 수 있는 염기를 제공합니다.
악토미오신 수축성을 활성화하는 세포 메커니즘은 잘 밝혀졌지만 동적 조직 리모델링을 조절하는 기능에 대한 우리의 이해는 불완전합니다. 이러한 지식 격차를 메우기 위해서는 생체 내 특정 조직 영역에서 악토미오신 (actomyosin)을 빠르게 비활성화하고 조직 거동 및 특성에 대한 즉각적인 영향을 기록할 수 있는 접근법이 필요합니다. 이 프로토콜은 초파리 중배엽 침윤 동안 악토미오신 수축성을 급격히 억제하기 위한 광유전학적 접근법의 사용을 설명하고 레이저 절제를 사용하여 상피 장력을 측정하는 것을 설명합니다. 초파리 위스트레이션(Drosophila gastrulation) 동안, 복부에 국한된 중배엽 전구체 세포는 정점 수축을 겪고 전후방 배향 고랑을 형성하여 배아 표면에서 침윤합니다22,23. 복부 고랑의 형성은 오랫동안 상피 접힘의 메커니즘을 연구하기위한 모델로 사용되어 왔습니다. 복부 고랑 형성은 Drosophila24,25,26,27의 등-복부 패턴 시스템에 의해 관리됩니다. 배아의 복부 쪽에 위치한 두 가지 전사 인자인 트위스트(Twist)와 달팽이(Snail)의 발현은 복부 고랑 형성을 조절하고 중배엽 세포의 운명을 지정한다28. Twist and Snail은 G-단백질 결합 수용체 경로와 RhoGEF2 어댑터 단백질인 T48 29,30,31,32,33을 통해 중배엽 전구체 세포의 정점으로 Rho1 GEF RhoGEF2의 모집을 활성화합니다. 다음으로, RhoGEF2는 Rho-Rho 키나아제 경로 34,35,36,37,38,39를 통해 잠재적 중배엽의 정점 표면 전체에 걸쳐 미오신을 활성화합니다. 활성화된 미오신은 중배엽 원시의 정점 표면 전체에 걸쳐 세포상 악토미오신 네트워크를 형성하며, 그 수축은 정점 수축을 유도하고 정점 조직 장력의 급격한 증가를 초래한다 14,37,40.
이 프로토콜에 설명된 광유전학적 도구인 Opto-Rho1DN은 Rho1(Rho1DN)41의 지배적인 음성 형태의 청색광 의존성 원형질막 모집을 통해 악토미오신 수축성을 억제합니다. Rho1DN의 T19N 돌연변이는 GDP를 GTP로 교환하는 돌연변이 단백질의 능력을 제거하여 단백질을 영구적으로 비활성화합니다34. Rho1DN, C189Y의 후속 돌연변이는 신호42,43을 표적으로 하는 순진한 막을 제거합니다. Rho1DN이 원형질막에 주입되면 Rho1 GEF에 결합하여 가두어 Rho1의 활성화와 미오신 및 액틴의 Rho1 매개 활성화를 차단합니다34,44. Rho1DN의 원형질막 모집은 Cryptochrome 2 및 결합 파트너 CIB1에서 파생된 광 의존성 이량체화 모듈을 통해 달성됩니다. 크립토크롬 2는 애기장대45에 있는 청색광 활성화 크립토크롬 광수용체입니다. 크립토크롬 2는 광여기 상태에서만 기본 나선-루프-나선 단백질인 CIB1에 결합합니다45. 크립토크롬 2(Cryptochrome 2, CRY2 PHR, 이하 CRY2로 지칭)와 CIB1(이하 CIBN)의 N-말단 도메인(aa 1-170)으로부터 보존된 N-말단, 광분해효소 상동성 영역(PHR)이 광-유도 이량체화에 중요하다는 것이 나중에 밝혀졌다46. Opto-Rho1DN에는 두 가지 구성 요소가 포함되어 있습니다. 제1 성분은 CAAX 앵커와 융합된 CIBN 단백질이며, 이는 단백질을 원형질막(47)에 국한시킨다. 두 번째 구성 요소는 Rho1DN41과 융합된 mCherry 태그가 부착된 CRY2입니다. 청색광이 없으면 CRY2-Rho1DN이 세포질에 남아 있습니다. 청색광 자극 시 CRY2-Rho1DN은 막 고정 CIBN과 여기 CRY2 사이의 상호 작용을 통해 원형질막을 표적으로 합니다. Opto-Rho1DN은 자외선 A (UVA) 광 및 청색광 (400-500 nm, 450-488 nm에서 피크 활성화) 또는 2 광자 자극41,46,47,48을 수행 할 때 830-980 nm 펄스 레이저에 의해 활성화 될 수 있습니다. 따라서 Opto-Rho1DN은 여기 GFP에 일반적으로 사용되는 파장(단일 광자 이미징의 경우 488nm, 이광자 이미징의 경우 920nm)에 의해 자극됩니다. 대조적으로, 여기 mCherry에 일반적으로 사용되는 파장(단일 광자 이미징의 경우 561nm, 이광자 이미징의 경우 1,040nm)은 광유전학적 모듈을 자극하지 않으므로 사전 자극 이미징에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 샘플 조작 중 원치 않는 자극의 위험을 최소화하는 데 사용되는 접근 방식을 설명합니다.
레이저 절제는 세포와 조직의 장력을 감지하고 측정하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다49. 이전 연구에서는 레이저 강도가 적절하게 제어될 때 펨토초 근적외선 레이저를 사용하는 이광자 레이저 절제가 원형질막 파거를 일으키지 않고 일부 세포 내 구조(예: 피질 악토미오신 네트워크)를 물리적으로 손상시킬 수 있음을 보여주었습니다(50,51). 조직이 장력을 받고 있는 경우 조직 내 관심 영역의 레이저 절제는 절제된 영역에 인접한 세포의 즉각적인 바깥쪽 반동을 초래합니다. 반동 속도는 장력의 크기 및 반동을 겪는 구조물을 둘러싼 매체(세포질)의 점도의 함수이다(49). 근적외선 레이저의 우수한 침투 깊이와 잘 제한된 초점 절제를 달성할 수 있는 능력으로 인해 이광자 레이저 절제는 생체 내에서 조직 장력을 감지하는 데 특히 유용합니다. 이 프로토콜에서 입증된 바와 같이, 이 방법은 동적 조직 리모델링 동안 조직 역학에 대한 Rho1 의존성 세포 수축성의 직접적인 영향을 조사하기 위해 악토미오신 수축성의 Opto-Rho1DN 매개 비활성화와 쉽게 결합될 수 있습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm &#215; 15 mm Petri dish with lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black cloth for covering the microscope</td>
			<td>Online</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10028-048</td>
			<td>Used for embryo dechorination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td>Used for cross set-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Style 5 tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-654</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22940-834</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView (Software)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image acquisition and optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td>Used for embryo stage visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ-745 stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image acquisition and optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30621-392</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)</td>
			<td>Bolioptics</td>
			<td>FM14036151</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic inhibition of rho1-mediated actomyosin contractility coupled with measurement of epithelial tension in drosophila embryos

액틴 및 비근육 미오신 II에 의해 생성된 수축력("악토미오신 수축성")은 세포 분열, 세포 이동, 상피 접힘 및 분지 형태 형성과 같은 여러 길이 척도에서 세포 및 조직의 형태학적 변화에 중요합니다. 형태 형성에서 악토미오신 수축성의 역할에 대한 심층적인 이해는 기존의 유전적 또는 약리학적 접근 방식으로는 달성하기 어려운 악토미오신 수축의 신속한 비활성화를 허용하는 접근 방식을 필요로 합니다. 제시된 프로토콜은 정확한 시간 및 공간 제어로 초파리 배아에서 악토미오신 수축성을 억제하기 위해 CRY2-CIBN 기반 광유전학적 이합체화 시스템인 Opto-Rho1DN의 사용을 보여줍니다. 이 시스템에서 CRY2는 Rho1(Rho1DN)의 우세한 음성 형태에 융합되는 반면 CIBN은 원형질막에 고정됩니다. CRY2 및 CIBN의 청색광 매개 이량체화는 세포질에서 원형질막으로 Rho1DN의 빠른 전좌를 초래하며, 여기서 내인성 Rho1을 억제하여 악토미오신 비활성화를 초래합니다. 또한, 이 기사는 초파리 복부 고랑 형성 동안 상피 긴장을 생성하는 악토미오신의 역할을 조사하기 위해 악토미오신의 Opto-Rho1DN 매개 비활성화와 레이저 절제를 결합하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 최소한의 수정으로 초파리 배아에서 악토미오신 수축성을 포함하는 다른 많은 형태학적 과정에 적용할 수 있습니다. 전반적으로, 이 광유전학적 도구는 동적 조직 리모델링 동안 조직 역학을 제어하는 악토미오신 수축성의 기능을 해부하는 강력한 접근 방식입니다.

Actomyosin contractility, the contractile force exerted by non-muscle myosin II (hereafter &#39;myosin&#39;) on the F-actin network, is one of the most important forces in changing cell shape and driving tissue-level morphogenesis1,2. For example, the activation of actomyosin contractility at the apical domain of the epithelial cells results in apical constriction, which facilitates a variety of morphogenetic processes, including epithelial folding, cell extrusion, delamination, and wound healing3,4,5,6,7. The activation of myosin requires phosphorylation of its regulatory light chain. This modification alleviates the inhibitory conformation of the myosin molecules, allowing them to form bipolar myosin filament bundles with multiple head domains on both ends. The bipolar myosin filaments drive the anti-parallel movement of actin filaments and result in the generation of contractile force1,8,9.
The evolutionarily conserved Rho family&#160;small GTPase RhoA (Rho1 in Drosophila)&#160;plays a central role in the activation of actomyosin contractility in various cellular contexts10,11. Rho1 functions as a bimolecular switch by binding either GTP (active form) or GDP (inactive form)12. The cycling between GTP- or GDP-bound Rho1 is regulated by its GTPase-activating proteins (GAPs) and guanine nucleotide-exchange factors (GEFs)13. GEFs function to facilitate the exchange of GDP for GTP and thus activate Rho1 activity. GAPs, on the other hand, enhance the GTPase activity of Rho1 and thus deactivate Rho1. Activated Rho1 promotes actomyosin contractility through interacting with and activating its downstream effectors, Rho-associated kinase (Rok) and Diaphanous14. Rok induces myosin activation and actomyosin contractility by phosphorylating the regulatory light chain of myosin15. In addition, Rok also inhibits the myosin regulatory light chain phosphatase, and hence further promotes myosin filament assembly16. Rok can also phosphorylate LIM kinases, which, when activated, prevent actin disassembly by phosphorylating and inhibiting the actin-depolymerization factor cofilin17,18. Diaphanous is a formin family actin nucleator that promotes actin polymerization, providing a base for myosin to interact with19,20,21.
While the cellular mechanisms that activate actomyosin contractility have been well elucidated, our understanding of its function in regulating dynamic tissue remodeling remains incomplete. Filling this knowledge gap requires approaches that can rapidly inactivate actomyosin at specific tissue regions in vivo and record the immediate impact on tissue behavior and properties. This protocol describes the use of an optogenetic approach to acutely inhibit actomyosin contractility during Drosophila mesoderm invagination, followed by measurement of epithelial tension using laser ablation. During Drosophila gastrulation, the ventrally localized mesoderm precursor cells undergo apical constriction and invaginate from the surface of the embryo by forming an anterior-posteriorly oriented furrow22,23. The formation of ventral furrows has long been used as a model for studying the mechanism of epithelial folding. Ventral furrow formation is administered by the dorsal-ventral patterning system in Drosophila24,25,26,27. The expression of two transcription factors, Twist and Snail, located at the ventral side of the embryo, controls ventral furrow formation and specifies mesodermal cell fate28. Twist and Snail activate the recruitment of the Rho1 GEF RhoGEF2 to the apex of the mesoderm precursor cells via a G-protein coupled receptor pathway and a RhoGEF2 adaptor protein, T4829,30,31,32,33. Next, RhoGEF2 activates myosin throughout the apical surface of the potential mesoderm through the Rho-Rho kinase pathway34,35,36,37,38,39. Activated myosin forms a supracellular actomyosin network throughout the apical surface of the mesoderm primordium, the contractions of which drive apical constriction and result in a rapid increase in apical tissue tension14,37,40.
The optogenetic tool described in this protocol, Opto-Rho1DN, inhibits actomyosin contractility through blue-light dependent plasma membrane recruitment of a dominant negative form of Rho1 (Rho1DN)41. A T19N mutation in Rho1DN eliminates the ability of the mutant protein to exchange GDP for GTP and thus renders the protein perpetually inactive34. A subsequent mutation in Rho1DN, C189Y, eliminates its naive membrane targeting signal42,43. When Rho1DN is infused to the plasma membrane, it binds to and impounds Rho1 GEFs, thereby blocking the activation of Rho1 as well as Rho1-mediated activation of myosin and actin34,44. The plasma membrane recruitment of Rho1DN is achieved through a light-dependent dimerization module derived from Cryptochrome 2 and its binding partner CIB1. Cryptochrome 2 is a blue-light activated Cryptochrome photoreceptor in Arabidopsis thaliana45. Cryptochrome 2 binds to CIB1, a basic helix-loop-helix protein, only in its photoexcited state45. It was later found that the conserved N-terminal, photolyase homology region (PHR), from Cryptochrome 2 (CRY2PHR, hereafter referred to as CRY2) and the N-terminal domain (aa 1-170) of CIB1 (hereafter CIBN) are important for light-induced dimerization46. Opto-Rho1DN contains two components. The first component is the CIBN protein fused with a CAAX anchor, which localizes the protein to the plasma membrane47. The second component is mCherry-tagged CRY2 fused with Rho1DN41. In the absence of blue light, CRY2-Rho1DN remains in the cytoplasm. Upon blue light stimulation, CRY2-Rho1DN is targeted to the plasma membrane through the interaction between membrane-anchored CIBN and excited CRY2. Opto-Rho1DN can be activated by ultraviolet A (UVA) light and blue light (400-500 nm, peak activation at 450-488 nm), or by an 830-980 nm pulsed laser when performing two-photon stimulation41,46,47,48. Therefore, Opto-Rho1DN is stimulated by wavelengths normally used for exciting GFP (488 nm for single photon imaging and 920 nm for two-photon imaging). In contrast, wavelengths commonly used for exciting mCherry (561 nm for single photon imaging and 1,040 nm for two-photon imaging) do not stimulate the optogenetic module and therefore can be used for pre-stimulation imaging. The protocol describes the approaches used to minimize the risk of unwanted stimulation during sample manipulation.
Laser ablation has been extensively employed to detect and measure tension in cells and tissues49. Previous studies have shown that, when laser intensity is appropriately controlled, two-photon laser ablation employing a femtosecond near-infrared laser can physically impair some subcellular structures (e.g., cortical actomyosin networks) without causing plasma membrane rapture50,51. If the tissue is under tension, laser ablation of a region of interest within the tissue results in an immediate outward recoil of the cells adjacent to the ablated region. The recoil velocity is a function of the magnitude of the tension and the viscosity of the media (cytoplasm) surrounding the structures undergoing recoil49. Because of the superior penetration depth of the near-infrared lasers and the ability to achieve well-confined focal ablation, two-photon laser ablation is particularly useful for detecting tissue tension in vivo. As demonstrated in this protocol, this method can be easily combined with Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin contractility to investigate the direct impact of Rho1-dependent cellular contractility on tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

저자 스포트라이트: Drosophila Embryos의 상피 장력 측정과 결합된 Rho1 매개 Actomyosin 수축성의 광유전학적 억제  

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

정점 수축을 겪고 있는 자극되지 않은 배아에서 Sqh-mCherry는 복부 중배엽 세포의 정근단 영역에서 농축된 반면 CRY2-Rho1DN-mCherry는 세포질이었습니다(그림 1A). 수축 영역 내의 레이저 절제는 AP 축을 따라 빠른 조직 반동을 일으켰습니다(그림 1B, C). 자극된 배아에서 CRY2-Rho1DN-mCherry 신호는 원형질막에 국한된 반면, Sqh-mCherry의 정점 신호는 완전?...

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액토미오신 수축성은 세포 및 조직 형태 형성에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 생체 내에서 악토미오신 수축성을 급격히 조작하는 것은 어렵다. 이 프로토콜은 초파리 배아에서 Rho1 매개 악토미오신 수축성을 빠르게 억제하는 광유전학적 시스템을 설명하여 생체 내에서 악토미오신이 비활성화된 후 상피 긴장의 즉각적인 손실을 나타냅니다.

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

우리의 연구는 발달중인 복잡한 3 차원 조직 구조의 형성 인 조직 형태 형성을 연구합니다. 우리는 형태 형성을 조절하는 유전자와 분자에 관심이 있으며 형태 형성의 기초가 되는 물리적 원리를 이해하려고 합니다. 예를 들어, 기계적 힘이 어떻게 생성되고 조직 재활을 유도하는지.액토미오신 수축성으로도 알려진 필라멘트 액틴과 비근육 미오신 II에 의해 생성된 수축력은 조직 형태 형성을 유도하는 가장 중요한 힘 중 하나입니다. 우리의 현재 연구는 악토미오신 수축성이 발달 중인 기본 조직 구성 메커니즘인 혈액 상피 세포 시트의 접힘을 매개하는 방법을 다룹니다. 상피 접힘 및 기타 형태 형성 과정에서 악토미오신 수축성의 역할에 대한 심층적인 이해는 지정된 시간과 위치에서 악토미오신 신속하게 비활성화할 수 있는 접근 방식을 필요로 하며 조직 행동 및 특성의 즉각적인 영향을 기록합니다.그러나 이것은 기존의 유전적 접근 방식을 사용하여 달성하기 어렵습니다. 이 프로토콜에 설명된 접근 방식은 일반적으로 조직 리모델링을 구동하는 기계적 힘의 갑작스러운 변화에 세포와 조직이 어떻게 반응하는지 설명하도록 설계되었습니다. 이것은 중요한 질문이지만 손상되지 않은 조직의 기계적 힘을 빠르게 변경할 수 있는 제한된 접근 방식으로 인해 해결하기가 어려웠습니다.이 연구에서 우리는 초파리 배아의 특정 조직 영역에서 악토미오신 신속하게 비활성화하는 광유전학적 도구를 개발했습니다. 우리는 이 두 가지를 레이저 절제와 결합하여 상피 접힘의 조직 역학에 대한 악토미오신 수축성의 직접적인 영향을 조사한다는 것을 발견했습니다. 우리의 발견은 상피 접힘에 대한 기계적 메커니즘, 정점 수축 매체에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.수동 수정을 통해 프로토콜은 광범위한 형태 발생 과정에서 악토미오신 수축성의 기능을 연구하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

optogenetic-inhibition-rho1-mediated-actomyosin-contractility-coupled

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

1.0K 조회수.  Dartmouth College. 우리의 연구는 발달중인 복잡한 3 차원 조직 구조의 형성 인 조직 형태 형성을 연구합니다. 우리는 형태 형성을 조절하는 유전자와 분자에 관심이 있으며 형태 형성의 기초가 되는 물리적 원리를 이해하려고 합니다. 예를 들어, 기계적 힘이 어떻게 생성되고 조직 재활을 유도하는지.액토미오신 수축성으로도 알려진 필라멘트 액틴과 비근육 미오신 II에 의해 생성된 수축...

비디오: 저자 스포트라이트: Drosophila Embryos의 상피 장력 측정과 결합된 Rho1 매개 Actomyosin 수축성의 광유전학적 억제  

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.