Yazarlar, görüntüleme desteği için Ann Lavanway'e teşekkür eder. Yazarlar, reaktifleri paylaştıkları için Wieschaus laboratuvarına ve De Renzis laboratuvarına ve sinek stokları için Bloomington Drosophila Stok Merkezi'ne teşekkür ediyor. Bu çalışma NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 ve Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Hibesi #IRG-82-003-33 tarafından BH'ye desteklenmektedir.

Drosophila'da Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan ederler.

Bu protokol, aktomiyosin kontraktilitesinin inaktivasyonundan hemen sonra doku gerginliğindeki değişiklikleri araştırmak için optogenetik ve lazer ablasyonun birlikte kullanımını tanımladı. Burada tarif edilen optogenetik araç, endojen Rho1 ve Rho1'e bağımlı aktomiyosin kontraktilitesini akut olarak inhibe etmek için baskın negatif Rho1 (Rho1DN) formundan yararlanır. Drosophila ventral karık oluşumu bağlamında Opto-Rho1DN'nin önceki karakterizasyonu, aletin eşzamanlı miyozin inaktivasyon...

Kassız miyozin II'nin (bundan böyle 'miyozin' olarak anılacaktır) F-aktin ağına uyguladığı kasılma kuvveti olan aktomiyosin kontraktilitesi, hücre şeklini değiştirmede ve doku düzeyinde morfogeneziyönlendirmede en önemli kuvvetlerden biridir 1,2. Örneğin, epitel hücrelerinin apikal alanında aktomiyosin kontraktilitesinin aktivasyonu, epitel katlanması, hücre ekstrüzyonu, delaminasyon ve yara iyileşmesi dahil olmak üzere çeşitli morfogenetik süreçleri kolaylaştıran apikal daralma ile sonuçlanır 3,4,5,6,7 . Miyozinin aktivasyonu, düzenleyici hafif zincirinin fosforilasyonunu gerektirir. Bu modifikasyon, miyozin moleküllerinin inhibitör konformasyonunu hafifleterek, her iki uçta birden fazla baş alanına sahip bipolar miyozin filament demetleri oluşturmalarına izin verir. Bipolar miyozin filamentleri, aktin filamentlerinin anti-paralel hareketini yönlendirir ve kasılma kuvveti 1,8,9 oluşumuna neden olur.
Evrimsel olarak korunmuş Rho ailesi küçük GTPase RhoA (Drosophila'da Rho1), çeşitli hücresel bağlamlarda aktomiyosin kontraktilitesinin aktivasyonunda merkezi bir rol oynar10,11. Rho1, GTP'yi (aktif form) veya GDP'yi (aktif olmayan form) bağlayarak bimoleküler bir anahtar olarak işlev görür12. GTP'ye veya GDP'ye bağlı Rho1 arasındaki döngü, GTPaz aktive edici proteinleri (GAP'ler) ve guanin nükleotid değişim faktörleri (GEF'ler) tarafından düzenlenir13. GEF'ler, GSYİH'nın GTP ile değişimini kolaylaştırma ve böylece Rho1 aktivitesini etkinleştirme işlevi görür. Öte yandan GAP'ler, Rho1'in GTPase aktivitesini arttırır ve böylece Rho1'i devre dışı bırakır. Aktive edilmiş Rho1, aşağı akış efektörleri, Rho ile ilişkili kinaz (Rok) ve Diaphanous14 ile etkileşime girerek ve aktive ederek aktomiyosin kasılmasını teşvik eder. Rok, miyozin15'in düzenleyici hafif zincirini fosforile ederek miyozin aktivasyonunu ve aktomiyosin kasılmasını indükler. Ek olarak, Rok ayrıca miyozin düzenleyici hafif zincir fosfatazı inhibe eder ve dolayısıyla miyozin filament düzeneğini daha da teşvikeder 16. Rok ayrıca, aktive edildiğinde, aktin-depolimerizasyon faktörü kofilin17,18'i fosforile ederek ve inhibe ederek aktinin parçalanmasını önleyen LIM kinazları fosforile edebilir. Diaphanous, aktin polimerizasyonunu destekleyen ve miyozinin 19,20,21 ile etkileşime girmesi için bir temel sağlayan bir formin ailesi aktin nükleatörüdür.
Aktomiyosin kontraktilitesini aktive eden hücresel mekanizmalar iyi aydınlatılmış olsa da, dinamik doku yeniden şekillenmesini düzenlemedeki işlevine ilişkin anlayışımız eksik kalmaktadır. Bu bilgi boşluğunu doldurmak, in vivo olarak belirli doku bölgelerinde aktomiyosini hızla etkisiz hale getirebilen ve doku davranışı ve özellikleri üzerindeki ani etkiyi kaydedebilen yaklaşımlar gerektirir. Bu protokol, Drosophila mezoderm invaginasyonu sırasında aktomiyosin kontraktilitesini akut olarak inhibe etmek için optogenetik bir yaklaşımın kullanımını ve ardından lazer ablasyonu kullanılarak epitel gerginliğinin ölçülmesini açıklar. Drosophila gastrulasyonu sırasında, ventral lokalize mezoderm öncü hücreleri apikal daralmaya uğrar ve ön-arka yönelimli bir karık oluşturarak embriyonun yüzeyinden invaze olur22,23. Ventral olukların oluşumu uzun zamandır epitelyal katlanma mekanizmasını incelemek için bir model olarak kullanılmaktadır. Ventral karık oluşumu, Drosophila24,25,26,27'de dorsal-ventral modelleme sistemi ile uygulanır. Embriyonun ventral tarafında bulunan iki transkripsiyon faktörünün, Twist ve Salyangoz'un ekspresyonu, ventral karık oluşumunu kontrol eder ve mezodermal hücre kaderini belirler28. Twist ve Salyangoz, bir G-proteinine bağlı reseptör yolu ve bir RhoGEF2 adaptör proteini, T48 29,30,31,32,33 yoluyla mezoderm öncü hücrelerinin tepesine Rho1 GEF RhoGEF2'nin alımını aktive eder. Daha sonra, RhoGEF2, Rho-Rho kinaz yolu 34,35,36,37,38,39 yoluyla potansiyel mezodermin apikal yüzeyi boyunca miyozini aktive eder. Aktive miyozin, mezoderm primordiumun apikal yüzeyi boyunca bir supraselüler aktomiyosin ağı oluşturur, kasılmaları apikal daralmaya neden olur ve apikal doku gerginliğinde hızlı bir artışa neden olur 14,37,40.
Bu protokolde tarif edilen optogenetik araç, Opto-Rho1DN, baskın bir negatif Rho1 (Rho1DN) 41 formunun mavi ışığa bağlı plazma membranı alımı yoluyla aktomiyozin kontraktilitesini inhibe eder. Rho1DN'deki bir T19N mutasyonu, mutant proteinin GDP'yi GTP ile değiştirme yeteneğini ortadan kaldırır ve böylece proteini sürekli olarak inaktif hale getirir34. Rho1DN'deki müteakip bir mutasyon olan C189Y, saf membran hedefleme sinyalini42,43 ortadan kaldırır. Rho1DN plazma membranına infüze edildiğinde, Rho1 GEF'lere bağlanır ve onu tutar, böylece Rho1'in aktivasyonunun yanı sıra miyozin ve aktinin Rho1 aracılı aktivasyonunu bloke eder34,44. Rho1DN'nin plazma membranı alımı, Cryptochrome 2 ve onun bağlanma ortağı CIB1'den türetilen ışığa bağlı bir dimerizasyon modülü aracılığıyla sağlanır. Cryptochrome 2, Arabidopsis thaliana45'te mavi ışıkla aktive olan bir Cryptochrome fotoreseptörüdür. Kriptokrom 2, temel bir sarmal-döngü-sarmal proteini olan CIB1'e yalnızca foto-uyarılmış durumundabağlanır 45. Daha sonra, Kriptokrom 2'den (CRY2 PHR, bundan sonra CRY2 olarak anılacaktır) ve CIB1'in (bundan sonra CIBN olarak anılacaktır) N-terminal alanından (aa 1-170) korunmuş N-terminali, fotoliyaz homoloji bölgesinin (PHR) ışık kaynaklı dimerizasyon için önemli olduğu bulunmuştur46. Opto-Rho1DN iki bileşen içerir. İlk bileşen, proteini plazma zarına47 lokalize eden bir CAAX çapası ile kaynaşmış CIBN proteinidir. İkinci bileşen, Rho1DN41 ile kaynaşmış mCherry etiketli CRY2'dir. Mavi ışığın yokluğunda, CRY2-Rho1DN sitoplazmada kalır. Mavi ışık stimülasyonu üzerine, CRY2-Rho1DN, membrana bağlı CIBN ve uyarılmış CRY2 arasındaki etkileşim yoluyla plazma membranına hedeflenir. Opto-Rho1DN, ultraviyole A (UVA) ışığı ve mavi ışık (400-500 nm, 450-488 nm'de tepe aktivasyonu) veya iki foton stimülasyonu41,46,47,48 gerçekleştirirken 830-980 nm darbeli lazer ile aktive edilebilir. Bu nedenle, Opto-Rho1DN, normalde heyecan verici GFP için kullanılan dalga boyları tarafından uyarılır (tek foton görüntüleme için 488 nm ve iki foton görüntüleme için 920 nm). Buna karşılık, heyecan verici mCherry için yaygın olarak kullanılan dalga boyları (tek foton görüntüleme için 561 nm ve iki foton görüntüleme için 1.040 nm) optogenetik modülü uyarmaz ve bu nedenle ön stimülasyon görüntüleme için kullanılabilir. Protokol, numune manipülasyonu sırasında istenmeyen stimülasyon riskini en aza indirmek için kullanılan yaklaşımları açıklar.
Lazer ablasyon, hücrelerdeki ve dokulardaki gerilimi tespit etmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır49. Önceki çalışmalar, lazer yoğunluğu uygun şekilde kontrol edildiğinde, femtosaniye yakın kızılötesi lazer kullanan iki fotonlu lazer ablasyonunun, plazma membranı yırtılmasına neden olmadan bazı hücre altı yapıları (örneğin, kortikal aktomiyosin ağları) fiziksel olarak bozabileceğini göstermiştir50,51. Doku gergin ise, doku içindeki ilgilenilen bir bölgenin lazerle ablasyonu, ablasyon bölgesine bitişik hücrelerin hemen dışa doğru geri tepmesine neden olur. Geri tepme hızı, gerilimin büyüklüğünün ve geri tepmeye maruz kalan yapıları çevreleyen ortamın (sitoplazma) viskozitesinin bir fonksiyonudur49. Yakın kızılötesi lazerlerin üstün penetrasyon derinliği ve iyi sınırlandırılmış fokal ablasyon elde etme yeteneği nedeniyle, iki fotonlu lazer ablasyonu, in vivo doku gerginliğini tespit etmek için özellikle yararlıdır. Bu protokolde gösterildiği gibi, bu yöntem, dinamik doku yeniden şekillenmesi sırasında Rho1'e bağımlı hücresel kontraktilitenin doku mekaniği üzerindeki doğrudan etkisini araştırmak için aktomiyosin kontraktilitesinin Opto-Rho1DN aracılı inaktivasyonu ile kolayca birleştirilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm &#215; 15 mm Petri dish with lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black cloth for covering the microscope</td>
			<td>Online</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10028-048</td>
			<td>Used for embryo dechorination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td>Used for cross set-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Style 5 tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-654</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>22940-834</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView (Software)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image acquisition and optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon oil 27</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773-100ML</td>
			<td>Used for embryo stage visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ-745 stereoscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for image acquisition and optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30621-392</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)</td>
			<td>Bolioptics</td>
			<td>FM14036151</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to avoid unwanted light stimulation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic inhibition of rho1-mediated actomyosin contractility coupled with measurement of epithelial tension in drosophila embryos

Aktin ve kas dışı miyozin II ("aktomiyosin kontraktilitesi") tarafından üretilen kasılma kuvvetleri, hücre bölünmesi, hücre göçü, epitelyal katlanma ve dallanma morfogenezi gibi çoklu uzunluk ölçeklerinde hücrelerin ve dokuların morfolojik değişiklikleri için kritik öneme sahiptir. Aktomiyosin kontraktilitesinin morfogenezdeki rolünün derinlemesine anlaşılması, geleneksel genetik veya farmakolojik yaklaşımlar kullanılarak elde edilmesi zor olan aktomiyosinin hızlı inaktivasyonuna izin veren yaklaşımlar gerektirir. Sunulan protokol, hassas zamansal ve uzamsal kontrollerle Drosophila embriyolarında aktomiyosin kontraktilitesini inhibe etmek için CRY2-CIBN tabanlı bir optogenetik dimerizasyon sistemi olan Opto-Rho1DN'nin kullanımını göstermektedir. Bu sistemde, CRY2, baskın negatif Rho1 formuna (Rho1DN) kaynaştırılırken, CIBN plazma zarına bağlanır. CRY2 ve CIBN'nin mavi ışık aracılı dimerizasyonu, Rho1DN'nin sitoplazmadan plazma membranına hızlı bir şekilde translokasyonuna neden olur ve burada endojen Rho1'i inhibe ederek aktomiyosini inaktive eder. Ek olarak, bu makale, Drosophila ventral karık oluşumu sırasında aktomiyosinin epitelyal gerginlik oluşturmadaki rolünü araştırmak için Opto-Rho1DN aracılı aktomiyosin inaktivasyonunu lazer ablasyonu ile birleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, Drosophila embriyolarında aktomiyozin kontraktilitesini içeren diğer birçok morfolojik sürece minimal modifikasyonlarla uygulanabilir. Genel olarak, bu optogenetik araç, dinamik doku yeniden şekillenmesi sırasında doku mekaniğini kontrol etmede aktomiyosin kontraktilitesinin işlevini incelemek için güçlü bir yaklaşımdır.

Actomyosin contractility, the contractile force exerted by non-muscle myosin II (hereafter &#39;myosin&#39;) on the F-actin network, is one of the most important forces in changing cell shape and driving tissue-level morphogenesis1,2. For example, the activation of actomyosin contractility at the apical domain of the epithelial cells results in apical constriction, which facilitates a variety of morphogenetic processes, including epithelial folding, cell extrusion, delamination, and wound healing3,4,5,6,7. The activation of myosin requires phosphorylation of its regulatory light chain. This modification alleviates the inhibitory conformation of the myosin molecules, allowing them to form bipolar myosin filament bundles with multiple head domains on both ends. The bipolar myosin filaments drive the anti-parallel movement of actin filaments and result in the generation of contractile force1,8,9.
The evolutionarily conserved Rho family&#160;small GTPase RhoA (Rho1 in Drosophila)&#160;plays a central role in the activation of actomyosin contractility in various cellular contexts10,11. Rho1 functions as a bimolecular switch by binding either GTP (active form) or GDP (inactive form)12. The cycling between GTP- or GDP-bound Rho1 is regulated by its GTPase-activating proteins (GAPs) and guanine nucleotide-exchange factors (GEFs)13. GEFs function to facilitate the exchange of GDP for GTP and thus activate Rho1 activity. GAPs, on the other hand, enhance the GTPase activity of Rho1 and thus deactivate Rho1. Activated Rho1 promotes actomyosin contractility through interacting with and activating its downstream effectors, Rho-associated kinase (Rok) and Diaphanous14. Rok induces myosin activation and actomyosin contractility by phosphorylating the regulatory light chain of myosin15. In addition, Rok also inhibits the myosin regulatory light chain phosphatase, and hence further promotes myosin filament assembly16. Rok can also phosphorylate LIM kinases, which, when activated, prevent actin disassembly by phosphorylating and inhibiting the actin-depolymerization factor cofilin17,18. Diaphanous is a formin family actin nucleator that promotes actin polymerization, providing a base for myosin to interact with19,20,21.
While the cellular mechanisms that activate actomyosin contractility have been well elucidated, our understanding of its function in regulating dynamic tissue remodeling remains incomplete. Filling this knowledge gap requires approaches that can rapidly inactivate actomyosin at specific tissue regions in vivo and record the immediate impact on tissue behavior and properties. This protocol describes the use of an optogenetic approach to acutely inhibit actomyosin contractility during Drosophila mesoderm invagination, followed by measurement of epithelial tension using laser ablation. During Drosophila gastrulation, the ventrally localized mesoderm precursor cells undergo apical constriction and invaginate from the surface of the embryo by forming an anterior-posteriorly oriented furrow22,23. The formation of ventral furrows has long been used as a model for studying the mechanism of epithelial folding. Ventral furrow formation is administered by the dorsal-ventral patterning system in Drosophila24,25,26,27. The expression of two transcription factors, Twist and Snail, located at the ventral side of the embryo, controls ventral furrow formation and specifies mesodermal cell fate28. Twist and Snail activate the recruitment of the Rho1 GEF RhoGEF2 to the apex of the mesoderm precursor cells via a G-protein coupled receptor pathway and a RhoGEF2 adaptor protein, T4829,30,31,32,33. Next, RhoGEF2 activates myosin throughout the apical surface of the potential mesoderm through the Rho-Rho kinase pathway34,35,36,37,38,39. Activated myosin forms a supracellular actomyosin network throughout the apical surface of the mesoderm primordium, the contractions of which drive apical constriction and result in a rapid increase in apical tissue tension14,37,40.
The optogenetic tool described in this protocol, Opto-Rho1DN, inhibits actomyosin contractility through blue-light dependent plasma membrane recruitment of a dominant negative form of Rho1 (Rho1DN)41. A T19N mutation in Rho1DN eliminates the ability of the mutant protein to exchange GDP for GTP and thus renders the protein perpetually inactive34. A subsequent mutation in Rho1DN, C189Y, eliminates its naive membrane targeting signal42,43. When Rho1DN is infused to the plasma membrane, it binds to and impounds Rho1 GEFs, thereby blocking the activation of Rho1 as well as Rho1-mediated activation of myosin and actin34,44. The plasma membrane recruitment of Rho1DN is achieved through a light-dependent dimerization module derived from Cryptochrome 2 and its binding partner CIB1. Cryptochrome 2 is a blue-light activated Cryptochrome photoreceptor in Arabidopsis thaliana45. Cryptochrome 2 binds to CIB1, a basic helix-loop-helix protein, only in its photoexcited state45. It was later found that the conserved N-terminal, photolyase homology region (PHR), from Cryptochrome 2 (CRY2PHR, hereafter referred to as CRY2) and the N-terminal domain (aa 1-170) of CIB1 (hereafter CIBN) are important for light-induced dimerization46. Opto-Rho1DN contains two components. The first component is the CIBN protein fused with a CAAX anchor, which localizes the protein to the plasma membrane47. The second component is mCherry-tagged CRY2 fused with Rho1DN41. In the absence of blue light, CRY2-Rho1DN remains in the cytoplasm. Upon blue light stimulation, CRY2-Rho1DN is targeted to the plasma membrane through the interaction between membrane-anchored CIBN and excited CRY2. Opto-Rho1DN can be activated by ultraviolet A (UVA) light and blue light (400-500 nm, peak activation at 450-488 nm), or by an 830-980 nm pulsed laser when performing two-photon stimulation41,46,47,48. Therefore, Opto-Rho1DN is stimulated by wavelengths normally used for exciting GFP (488 nm for single photon imaging and 920 nm for two-photon imaging). In contrast, wavelengths commonly used for exciting mCherry (561 nm for single photon imaging and 1,040 nm for two-photon imaging) do not stimulate the optogenetic module and therefore can be used for pre-stimulation imaging. The protocol describes the approaches used to minimize the risk of unwanted stimulation during sample manipulation.
Laser ablation has been extensively employed to detect and measure tension in cells and tissues49. Previous studies have shown that, when laser intensity is appropriately controlled, two-photon laser ablation employing a femtosecond near-infrared laser can physically impair some subcellular structures (e.g., cortical actomyosin networks) without causing plasma membrane rapture50,51. If the tissue is under tension, laser ablation of a region of interest within the tissue results in an immediate outward recoil of the cells adjacent to the ablated region. The recoil velocity is a function of the magnitude of the tension and the viscosity of the media (cytoplasm) surrounding the structures undergoing recoil49. Because of the superior penetration depth of the near-infrared lasers and the ability to achieve well-confined focal ablation, two-photon laser ablation is particularly useful for detecting tissue tension in vivo. As demonstrated in this protocol, this method can be easily combined with Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin contractility to investigate the direct impact of Rho1-dependent cellular contractility on tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

Yazar Spotlight: Drosophila Embriyolarında Epitel Gerginliğinin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu  

Drosophila Embriyolarında Epitelyal Gerginliğin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu

Our research studies tissue morphogenesis, the formation of complex three-dimensional tissue structures in development. We are interested in the genes and the molecules that regulate morphogenesis and seek to understand the physical principles underlying morphogenesis. For example, how mechanical forces are generated and how they drive tissue rehabilitation.Contractile forces generated by filamentous actin and non-muscle myosin II, also known as actomyosin contractility, is one of the most important forces that drive tissue morphogenesis. Our current research addresses how actomyosin contractility mediates the folding of blood epithelial cell sheets, a fundamental tissue construction mechanism in development. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in epithelial folding and other morphogenetic processes requires approaches that can quickly inactivate actomyosin at designated time and location, and records the immediate impact of tissue behavior and properties.However, this is difficult to achieve using conventional genetic approaches. The approach described in this protocol is designed to address how cells and tissues respond to sudden changes in mechanical forces that normally drive tissue remodeling. This is an important question but has been difficult to tackle due to limited approaches that can quickly alter mechanical forces in intact tissues.In this study, we developed an optogenetic tool to inactivate actomyosin at specific tissue regions in Drosophila embryos quickly. We found that combining these two with laser ablation to investigate the direct impact of actomyosin contractility on tissue mechanics in epithelial folding. Our findings provide new insights into the mechanical mechanism apical constriction media to epithelial folding.With manual modifications, the protocol can be easily adapted to study the function of actomyosin contractility in a wide range of morphogenetic processes.

Apikal daralma geçiren uyarılmamış embriyolarda, Sqh-mCherry ventral mezodermal hücrelerin medioapikal bölgesinde zenginleşirken, CRY2-Rho1DN-mCherry sitozolik idi (Şekil 1A). Konstriksiyon alanı içindeki lazer ablasyonu, AP ekseni boyunca hızlı bir doku geri tepmesine yol açtı (Şekil 1B, C). Uyarılan embriyolarda, CRY2-Rho1DN-mCherry sinyali plazma membranı lokalize olurken, Sqh-mCherry'nin medioapikal sinyali tamamen kayboldu ...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos at JoVE.com

Aktomiyosin kontraktilitesi hücre ve doku morfogenezinde önemli bir rol oynar. Bununla birlikte, aktomiyosin kontraktilitesini in vivo akut olarak manipüle etmek zordur. Bu protokol, Drosophila embriyolarında Rho1 aracılı aktomiyosin kontraktilitesini hızla inhibe eden ve aktomiyozinin in vivo inaktivasyonundan sonra epitel gerginliğinin ani kaybını ortaya çıkaran bir optogenetik sistemi tanımlar.

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Araştırmamız, doku morfogenezini, gelişim aşamasındaki karmaşık üç boyutlu doku yapılarının oluşumunu inceler. Morfogenezi düzenleyen genler ve moleküllerle ilgileniyoruz ve morfogenezin altında yatan fiziksel ilkeleri anlamaya çalışıyoruz. Örneğin, mekanik kuvvetlerin nasıl üretildiği ve doku rehabilitasyonunu nasıl yönlendirdikleri.Aktomiyosin kontraktilitesi olarak da bilinen filamentli aktin ve kas dışı miyozin II tarafından üretilen kasılma kuvvetleri, doku morfogenezini yönlendiren en önemli kuvvetlerden biridir. Mevcut araştırmamız, aktomiyosin kontraktilitesinin, gelişimde temel bir doku yapım mekanizması olan kan epitel hücre tabakalarının katlanmasına nasıl aracılık ettiğini ele almaktadır. Aktomiyosin kontraktilitesinin epitelyal katlanma ve diğer morfogenetik süreçlerdeki rolünün derinlemesine anlaşılması, belirlenen zaman ve yerde aktomiyosini hızlı bir şekilde etkisiz hale getirebilen ve doku davranışı ve özelliklerinin ani etkisini kaydedebilen yaklaşımlar gerektirir.Bununla birlikte, geleneksel genetik yaklaşımlar kullanılarak bunu başarmak zordur. Bu protokolde açıklanan yaklaşım, hücrelerin ve dokuların, normalde doku yeniden şekillenmesini sağlayan mekanik kuvvetlerdeki ani değişikliklere nasıl tepki verdiğini ele almak için tasarlanmıştır. Bu önemli bir sorudur, ancak sağlam dokulardaki mekanik kuvvetleri hızla değiştirebilen sınırlı yaklaşımlar nedeniyle ele alınması zor olmuştur.Bu çalışmada, Drosophila embriyolarında belirli doku bölgelerinde aktomiyosini hızlı bir şekilde inaktive etmek için optogenetik bir araç geliştirdik. Aktomiyosin kontraktilitesinin epitelyal katlanmada doku mekaniği üzerindeki doğrudan etkisini araştırmak için bu ikisini lazer ablasyon ile birleştirdiğimizi bulduk. Bulgularımız, apikal daralma ortamının epitelyal katlanmaya mekanik mekanizması hakkında yeni bilgiler sunmaktadır.Manuel modifikasyonlarla, protokol, çok çeşitli morfogenetik süreçlerde aktomiyosin kontraktilitesinin işlevini incelemek için kolayca uyarlanabilir.

optogenetic-inhibition-rho1-mediated-actomyosin-contractility-coupled

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

1.0K Görüntüleme.  Dartmouth College. Araştırmamız, doku morfogenezini, gelişim aşamasındaki karmaşık üç boyutlu doku yapılarının oluşumunu inceler. Morfogenezi düzenleyen genler ve moleküllerle ilgileniyoruz ve morfogenezin altında yatan fiziksel ilkeleri anlamaya çalışıyoruz. Örneğin, mekanik kuvvetlerin nasıl üretildiği ve doku rehabilitasyonunu nasıl yönlendirdikleri.Aktomiyosin kontraktilitesi olarak da bilinen filamentli aktin ve kas dışı miyozin II tarafından üretilen kasılma kuvvet...

Video: Yazar Spotlight: Drosophila Embriyolarında Epitel Gerginliğinin Ölçümü ile Birlikte Rho1 Aracılı Aktomiyosin Kontraktilitesinin Optogenetik İnhibisyonu  