Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in rd10 Mice

首先，取一只麻醉的小鼠，将一滴1%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素滴入眼睛以扩张瞳孔。然后在角膜上涂抹眼胶，以防止干燥和麻醉引起的白内障。接下来，在无菌环境中设置具有直射光路的直立手术显微镜以进行视网膜下注射。

要制备 10 微升玻璃注射器，请拆下针头轮毂并连接 33 号钝针。取下金属轮毂盖，将针头牢固地固定在注射器上。用蒸馏水冲洗针头，以测试渗漏和针头通畅性。

然后清空注射器并小心地放在一边。接下来，将麻醉的小鼠放在垫子上，并将治疗眼朝向显微镜的物镜。涂抹0.5%盐酸丙对哌卡因，等待30秒。

然后将 150 微升眼凝胶涂抹在眼睛上并贴上圆形盖玻片。进行初步眼科检查，观察角膜、虹膜、瞳孔、晶状体和结膜。调整焦平面以通过瞳孔可视化鼠标眼底。

然后对齐头部，使光学头与瞳孔中心对齐。之后，轻拍含有HESC衍生的感光祖细胞的试管底部，以获得均匀的细胞悬浮液。使用 10 微升玻璃微升注射器和 33 号钝针，抽取 2 微升细胞混合物。

使用 30 号一次性针头在角膜缘后方 2 毫米处创建阴囊切除术伤口。将针头的角度保持在大约 45 度，以防止与镜片接触。一旦针尖在眼睛内可见，小心地缩回针头。

将用过的针头丢弃到锋利的垃圾箱中，以防止针刺伤。现在拿起玻璃注射器，将钝针插入巩膜切除术伤口。在不接触晶状体的情况下推进钝针，直到它到达入口伤口的对面视网膜。

轻轻穿透视网膜，直到看到巩膜上的压力分支。然后将两微升细胞悬液或PRDM培养基注射到视网膜下空间，同时保持对注射器的温和压力。可见水泡的形成表明注射成功。

等待 10 秒钟，让细胞安顿下来。轻轻地将针头从眼睛上缩回。要可视化气泡，请移动鼠标头部以将眼睛定位在显微镜下，并通过轻轻握住头部来固定位置。

对于术中 OCT，使用手术显微镜上的 IOCT 功能并在 OCT 屏幕上选择立方体。按箭头按钮将扫描区域定位在气泡上。要调整 OCT、滑动居中和对焦以获得最佳 OCT 质量，请按捕获或扫描以获取气泡区域的 OCT 扫描并查看图像以检查扫描质量。

最后，取下盖玻片，用纱布轻轻清洁眼睛上的凝胶。注射后给予一次抗生素软膏，以防止感染。OCT 扫描显示悬浮在细胞治疗的眼睛中的不同 HESC 实体。

相比之下，培养基治疗的眼睛显示无混浊的液体，视网膜下空间内没有细胞。