这是第一份报告，证明超声心动图引导的经皮心肌内注射心肌细胞可显着增强人iPS来源的心肌细胞的修复特性。该方法是可行的、令人满意的、可重复的、侵入性较小的和有效的程序，用于递送人iPS来源的心肌细胞治疗。我们认为，经皮心肌内给药是缺血性心脏病、心肌梗塞和心力衰竭等疾病的局部给药安全有效的方法。
本项目由杨金福教授和彭军教授指导。演示该程序的将是我实验室的医学博士Xun Wu，Kele Qin和Kun Xiang以及湖南省心血管研究重点实验室的博士Di Wang。首先，从 hiPSC-CM 培养物的 60 天中真空吸出培养物上清液。
用PBS洗涤细胞三次。然后使用37摄氏度的细胞分离酶混合物将hiPSC-CMs解离成单个细胞三到五分钟。将细胞收集在含有5毫升RPMI加B27培养基的15毫升管中并混合。
计算单元格数并计算单元格总数。在室温下以300G离心细胞悬液两分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于心肌细胞支持培养基中至每微升第4个细胞的浓度为6×10。
将试管置于37摄氏度直至注射步骤。小鼠充分麻醉后，用胶带固定四肢和尾巴。然后，用 2/0 丝线和胶带固定鼠标门牙。
用三轮交替的甜菜碱和酒精对正中颈部和左胸部进行消毒。使用精细解剖剪刀和精细解剖钳做一个颈部正中切口。切掉几块颈椎前部肌肉，以稳定并充分暴露气管。
将 20 号导管穿刺针作为气管插管插入口腔。将气管插管连接到呼吸机并检查胸腔运动，以确保双肺通风良好。调整呼吸参数。
接下来，将左后肢重新固定到右下侧，并松开左上肢周围的胶带。用细夹剪和镊子，在左胸的三到四个肋间间隙进行开胸术。使用镊子，剥离心包并定位左前降冠状动脉。
使用 6/0 丝线结扎动脉近端。为确保建立急性心肌梗死模型，请等到结扎部位的动脉远端由红色变为白色。逐层关闭胸部，并用4/0线缝合皮肤。
对于假动物组，执行除结扎以外的所有外科手术。在心肌梗死后的前两周，将小鼠置于与5%异氟烷连接的麻醉盒中进行气管插管。在给予hiPSC-CMs前三天，以每天每公斤10毫克的剂量将环孢素A注射到腹膜腔内。
用脱毛膏去除小鼠胸部和上腹部的毛发。供应吸入异氟烷，直到心率保持在每分钟 400 至 500 次。在检测控制台上用胶带固定鼠标四肢和尾巴，并将平台温度设置为 37 摄氏度。
将超声波果冻涂抹在上腹部。使用高分辨率兽医超声探头，获得小鼠肝脏图像。使用5微升微型注射器，将约3 x 10吸入第5个hiPSC-CM。
握住注射器并在左旁突插入三毫米针头。在超声引导下，沿着横膈膜的上边缘。观察呼吸节律和范围。
在呼气圈末端进入心包，避免损害肝脏和肺部。然后通过B型超声心动图获取小鼠心脏的胸骨旁长轴图像。在超声引导下，将1 x 10至第5个hiPSC-CMs细胞注射到梗死部位的三个边缘区域中的每一个。
取下超声探头并冲洗掉果冻。使小鼠脱离麻醉并将其放回笼子中。移植后连续注射环孢素A一个月。
左心室超声心动图显示，多剂量组心肌梗死损伤逆转。hiPSC-CMs的移植也导致射血分数增加和分数缩短。使用天狼星红和快绿染色测量心脏参数显示，移植后梗死大小和胶原体积分数减少，而左心室前壁厚度增加。
绿色非特异性α肌动蛋白标记，蓝色DAPI标记，红色标记人特异性肌钙蛋白T显示梗死和边缘梗死区域存在移植细胞。与单剂量相比，多剂量组移植细胞的数量和百分比更高。心肌梗死后28天，多剂量组显示表达内皮细胞标志物I-B4的细胞数量增加。
心肌细胞上的小麦胚芽凝集素和肌瘤α肌动蛋白染色显示最小纤维直径减小。多剂量组中隧道阳性心肌细胞核数量较少表明细胞凋亡减少。PCR分析仅在心脏中检测到人类线粒体DNA，显示特异性移植。
插入针头时，请确保它与横膈膜的上缘和呼气圈的末端一起进入心包腔，以避免对肝脏或肺部造成伤害。
