设计 sgRNA 并构建基因组编辑载体以培育抗性淀粉水稻

首先，导航到 NCBI 网站，从 Japonica Rice 品种中检索所需的基因。在 SNAP 基因软件中下载并访问参考基因组。分析 X134 品种的 O-S-S-B-E 2B 外显子序列内的插入或缺失以及单核苷酸多态性，并将其与参考基因组进行比较。

使用 NCBI 引物原始细胞工具，设计引物，侧翼外显子区域。为了通过 Sanger 测序验证 X134 中 O-S-S-B-E 2B 基因的外显子序列，请准备反应并使用适当的设置运行 PCR 程序。在 X134 的 O-S-S-B-E 2B 外显子序列上设计单向导 RNA 或 S-G-R-N-A，遵循方案，并确保原始间隔区相邻基序序列为 TTN。

在正向引物的 5 个主要端添加 CAC OLIGOS，在反向引物的 5 个主要端添加 GGCC OLIGOS。溶解引物后，将每种引物的 1 微升与 8 微升退火缓冲液混合。将混合物放入 PCR 机中并运行退火程序。

将 S-G-R-N-A 组装到基因组编辑载体中并运行 PCR 组装程序。将所得载体转化到大肠杆菌细胞中，并对单个菌落进行 PCR 扩增，以筛选成功插入，从而使用 Sanger 测序确认克隆成功。