首先,收获突变体和 X134 植物的种子,让它们在室温下自然干燥,直到水分含量达到约 13% 至 15%启动去皮机后,将 10 克米粒放入喂食器中,以有效去除颖壳。将去皮的米籽转移到碾米机中,操作机器 60 秒,以去除糊粉层,产生精米。接下来,将精米放入纸巾研磨机中。
将研磨频率调整为 60 Hz,并运行研磨机 15 秒,持续两个周期以生产米粉。将磨碎的米粉放入培养皿中,放入预热至 37 摄氏度的烤箱中 12 小时。然后将 100 mg 米粉加入 2 mL 微量离心管中,轻轻敲击管。
向试管中加入 180 L 纯净水,将样品在水浴中煮沸 20 分钟。样品冷却后,将 4 mL 含有胰腺 α 淀粉酶的 AMG 引入试管中。接下来,在涡旋振荡器上混合内容物,并在 37 C 下连续搅拌孵育试管 16 小时。
现在,加入 4 mL 乙醇并使用涡旋混合样品。然后将试管以 1, 500 G 离心 10 分钟。倾析上清液后,向试管中加入 2 mL 50% 乙醇,然后加入 6 mL 50%IMS 并混合。
离心管后,小心地倒出上清液并倒置管以排出多余的液体。将试管置于冰浴中,加入 2 mL 2 摩尔氢氧化钾,搅拌样品 20 分钟,以重新悬浮羊群并溶解抗性淀粉。向试管中加入 8 mL 调节至 pH 3.8 的 1.2 摩尔乙酸钠缓冲液,并使用磁力搅拌器混合。
然后立即将 0.1 mL AMG 加入混合物中并充分混合。将样品在 50 C 下在水浴中孵育 30 分钟,并使用涡旋间歇混合。孵育后,将试管以 1, 500 G 离心 10 分钟。
现在将 0.1 mL 上清液转移到新的玻璃管中。加入 3 mL 葡萄糖氧化酶过氧化物酶试剂,将样品在 50 C 下孵育 20 分钟。小心地将 200 L 每种空白样品溶液和标准溶液移液到 96 孔板中。
测量每个样品在 510 nm 处相对于空白溶液的吸光度,并使用公式计算抗性淀粉含量。最后,向参与者提供 50 克准备好的大米和 200 毫升的水。饭后,在不同时间点采集静脉血样进行血糖分析。
与野生型相比,SBEIIb 突变体的抗性淀粉含量显著升高 5.2%。食用准备好的大米导致 15 分钟和 30 分钟时的葡萄糖反应变慢和降低,分别降低 9.7% 和 3.7%。