使用 Microwell 技术一致生成人类血管类器官

首先，将一根 50 毫升的试管放在冰上，然后依次添加胶原蛋白 1 溶液和其他成分。摇动试管以充分混合。使用 P10 移液器，在摇动混合溶液的同时滴加 1 摩尔氢氧化钠溶液，将 pH 值调节至 7.3。

将 1.25 毫升基底膜基质添加到 5 毫升胶原蛋白一混合物中，轻轻混合溶液。接下来，将 12 孔板置于冰上 2 分钟。使用大口径尖端，将胶原蛋白一基底膜基质混合物缓慢添加到 12 孔板中。

将 12 孔板置于 37 摄氏度的培养箱中 2 小时，以固化第一层水凝胶。将剩余的胶原蛋白 1 基底膜基质混合物保存在冰上以备后用。然后将大约 60 个细胞聚集体转移到 1.5 mL 微量离心管中。

然后将试管在冰上冷却 5 分钟。使用 P200 移液器吸头，小心地从试管中取出培养基。将 1.5 毫升胶原蛋白一基底膜混合物滴加到细胞聚集体中，并使用大口径 P200 移液器吸头轻轻混合以重悬。

将带有第一层水凝胶的板从培养箱转移到生物安全柜中。将 1.5 毫升聚集体悬浮液添加到固化的水凝胶层上，轻轻摇动板以使聚集体均匀分布。将板在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育 2 小时。

将血管分化培养基 2 在 37 摄氏度的水浴中预热 20 分钟。向每个孔中加入 2 毫升培养基，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养细胞。每三天更换一次培养基，用新鲜的预热血管分化培养基 2。

类器官表达 CD31 、 ERG1 和 PDGFR β，表明存在血管内皮细胞和寄生虫。组织透明化后，通过整装免疫荧光显微镜观察血管网络。第 17 天染色的成熟类器官显示血管网络将球体包裹在凝胶块内。

第 28 天检索的类器官具有包裹在球状体周围的维管网络，而不是径向扩张。