该协议使我们能够以一种简单且具有成本效益的方式创建一个复杂的3D结构，该结构与发育中的人类心脏非常相似，并且可以跨细胞系重复。它由具有三个分化步骤的单一方案组成，从而产生了心脏的所有细胞类型，包括腔室和血管网络。这项技术使我们能够模拟各种人类心血管疾病，并筛选有效的药物治疗。
由于其设计的高吞吐量特性。这种方法可用于研究发育中的人类心脏以及通常与之相关的疾病。其中之一是先天性心脏缺陷。
该协议需要基本的细胞培养技能。我们建议细心和细致的移液以及轻柔地处理类器官。首先在分化前两天创建胚胎体或EB。
将亚汇合的 HPSC 与 DBPS 洗涤至少 10 秒钟。然后吸出DPBS。加入一毫升室温ACUTA，轻轻敲击板，每分钟轻轻敲击五次，持续三到五分钟以诱导脱离，同时在显微镜下检查。
然后加入一毫升PSC培养基和Thias Avin或Thias以停止反应。在孔中上下移液培养基，两到三次以产生单个细胞悬浮液并收集细胞。然后将单细胞悬浮液转移到离心管中，以300倍G.吸出上清液旋转五分钟，并将细胞重新消耗在一毫升PSC培养基和Thias中。
稀释DPBS中的细胞。使用细胞计数器或血囊肿计计数细胞，并将PSC培养基中的细胞与Thias稀释至每毫升100， 000个细胞的浓度。向圆底超低连接孔板96的每个孔中加入100微升稀释的细胞悬浮液。
将板以100倍G离心3分钟，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。24小时后，小心地从每个孔中取出50微升培养基，并加入200个核心凋落的新鲜PSC培养基，加热至37摄氏度，每孔体积为250微升。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。
从每个孔的一侧除去166微升或三分之二的培养基，并加入166微升含有无胰岛素B27补充剂的RPMI 1640，6微摩尔欢呼990211，0.875纳克每毫升骨形态发生蛋白4和1.5纳克每毫升Activin A.在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。24小时后，从每个孔的一侧取出166微升培养基，并加入166微升新鲜RPMI 1640和无胰岛素B27补充剂。在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育24小时。
为了在第二天诱导心脏中胚层规格，从每个孔中取出166微升培养基，加入166微升RPMI 1640，含有无胰岛素B27补充剂和三微摩尔Wnt-C59，并继续孵育48小时。在第四天，从每个孔中取出166微升培养基，加入166微升新鲜RPMI 1640和无胰岛素B27补充剂，然后再孵育48小时。在第六天，从每个孔中取出166微升培养基，并加入166微升RPMI 1640和B27补充剂。
对于这种和所有后续的培养基变化，使用B27补充胰岛素，再孵育24小时。在第七天，细胞培养物已准备好进行前心外膜分化。从每个孔中取出166微升培养基，加入166微升含有B27补充剂和三微摩尔cheer 99021的新鲜RPMI 1640。
然后在孵育一小时后，从培养箱中取出板，从每个孔的一侧取出166微升培养基，并加入166微升含有B27补充剂的新鲜RPMI 1640继续孵育48小时。每48小时重复一次此过程，直到收集。类器官已准备好在第15天进行分析和实验 要转移整个类器官，请将P200移液器的尖端从开口处切开5至10毫米，直径约为2至3毫米。
按下移液器柱塞，将吸头垂直插入带有类器官的圆底孔中。吸收大约100至200微升的培养基，足以收集类器官并将其转移到目标目的地。在分化EBS表现为黑色球形团块之前，分化过程从第0天开始，Wnt途径激活和生长因子添加正好24小时。
此外，在第二天对Wnt C59的编辑导致类器官从大约200微米扩大到最大一毫米。人类心脏类器官早在第六天就开始跳动，到第10天，100%的类器官显示出可见的跳动。第七天类器官的高放大倍率图像显示，大多数表达一的手细胞是起源于心肌细胞的，而第二手是来自第二个心场的非肌分裂细胞，即祖细胞。
第一手和第二手的RNA转录本从第三天开始在RNA测序数据中表达。FHF标记在第3天和第11天表达高度，而SF标记在第13天后表达得更高。免疫荧光染色揭示了构成人类心脏的各种人类心脏细胞类型谱系的存在。
例如心肌和心外膜组织、心内膜细胞、内皮细胞和心脏成纤维细胞。在RNA SAC基因表达谱中也观察到表达上述细胞谱系的标记。使用整个类器官中单个细胞的活钙成像来测量类器官的电生理功能。
Fluo-4荧光强度随时间而变化，因为钙从细胞中进入，显示出规律的动作电位。热图显示类器官高放大率区域的钙强度，显示由于钙瞬变和单个细胞而增加的强度。在尝试此方案时，请记住，EB和随后的类器官不会附着在板的底部，除了需要仔细更换培养基的培养基外，我们还将随着移除而移动。
类器官可以培养更长的时间引入成熟技术，甚至暴露于外部刺激，如机械或电调节，甚至压力源，如毒素。该技术允许进入人类胎儿心脏发育的阶段，否则这些阶段在研究中是无法进入的，为心脏发育和疾病病因学的新见解铺平了道路。
