这项工作是由美国国立卫生研究院授予DK080351 PC支持。

实验协议在这个试验性的协议的第一步是收集了大量鼠标脑垂体。第二个步骤是，同质化的腺体准备蛋白提取物。第三步是油性混合物乳化这些蛋白质。 第1步：鼠标脑垂体收集和储存鼠标脑下垂体位于颅底三叉神经和视交叉前方横向包围，在所谓蝶鞍蝶骨的抑郁症。腺体组成一个较大的前叶和较小的后部和中间叶，体重平均为1.9毫克。注定要被实施安乐死的动物护理设施的混合菌株，性别，和年龄，老鼠的脑垂体收集。 要隔离脑垂体，鼠标是安乐死，上述解剖颅骨的皮肤，并用剪刀剪开颅骨骨开放。解除大脑，脑垂体，然后从周围硬脑膜分离暴露，捞起来蝶骨上干冰的塑料管中。 一般来说，我们使用一个蛋白质的准备，可以由一人在9个小时收集的300鼠标脑垂体。 一旦收集完成，包含脑垂体管保存于-80 ° C，直到准备下一个步骤。 第2步。小鼠垂体蛋白的提取<ol><li>同质化的缓冲区，以添加15毫升猎鹰管（目录没有352059）保持在冰浴，每收集100脑垂体使用250的缓冲液。使用的是细胞质内的细胞生理pH（7.4）（0.2 M）和生理上的一个类似的离子强度缓冲。我们用磷酸盐缓冲液（0.161 M，pH值7.4），辅以一种蛋白酶抑制剂的鸡尾酒（Sigma - Aldrich公司，目录没有P8340 - 1ML）。 </li><li>添加脑垂体刚刚在同质化的缓冲区，然后将宝创匀浆发电机猎鹰管的底部（直径5毫米）。均质最高转速为30秒，轻轻移动猎鹰管向上和向下，同时保持在冰浴。然后休息1分钟冰匀浆。重复的同质化和冷却步骤两次。要打破这种温柔的同质化细胞，而不破坏的原子核并释放胞浆蛋白。 </li><li>要去除细胞核，完整的组织和不溶物（如结缔组织，变性的蛋白复合物），离心机在低转速（千克）的匀浆液在4 ° C 10分钟</li><li>转移上清（现在叫后核上清，PNS）到一个新的猎鹰管，照顾离开颗粒不受干扰，并存储在冰上的PNS的。 </li><li>在同质化的缓冲区的原始卷（250μL每收集100脑垂体的缓冲区）重悬沉淀，上述均质，离心上述，然后结合第二PNS的第一个。 </li><li>分装在两个汇集PNS的样品到离心管中并储存在-80 ° C直到为下一步做好准备。这种蛋白制备可存放于-80 ° C，但逐渐失去其效力，因此，我们建议在6个月从筹备内使用。使用一个小等分，以确定蛋白质产量和浓度由BCA检测（皮尔斯目录。23225），并通过凝胶电泳的蛋白质质量。在一般情况下，我们从300鼠标垂体获得约60毫克的蛋白质，同质化的缓冲液在1.5毫升，在浓度40毫克/毫升左右。 </li></ol>第3步。免疫乳液的制备<ol><li>迅速解冻实验所需的冷冻蛋白等分，调整蛋白浓度为20毫克/毫升。将这种蛋白质提取物乳化1:1与完全弗氏佐剂（终审法院，Sigma公司的F - 5881）含有5毫克/毫升杀害结核分枝杆菌（Becton Dickinson公司，231141）的热量。每个鼠标将获得1毫克的垂体提取物在100μL乳液。 </li><li>这里给出的例子是免疫10只小鼠，其中每个鼠标将注入100μL含有1毫克垂体蛋白质的乳液。允许两个额外的小鼠物质损失，所以在准备使用12毫克垂体蛋白质。上面描述的使用2.5毫升汉密尔顿气密性注射器的Aspire 600μL的20毫克/毫升垂体蛋白提取物。重悬通过晃动终审法院，并渴望进入另一个2.5 mL的汉密尔顿注射器的600μL的终审法院。连接和安全的一个22号的微乳化针头与终审法院填补了注射器。慢慢推针是与终审法院填补的终审法院注射器的柱塞，然后连接和安全的另一端充满垂体提取物的注射器针头。 </li><li>慢慢推进终审法院的注射器的柱塞推入acqueous脑垂体提取物，这样，只有少量混合油成分。然后向后推到终审法院的注射器柱塞的脑垂体中提取注射器。逐步增加混合材料的数量，重复此动作。继续混合，直到两个注射器的全部内容。您将获得代表的油包水型乳化发白和均匀分布的解决方案。 </li><li>一旦形成乳液，至少有500次重复的往复运动，以确保完全混合乳液。最终混合周期后，1:1的油包水型乳化液就可以使用，包含垂体蛋白浓度为10毫克/毫升。乳化将在同一天注射，皮下麻醉SJL小鼠，在同伴的Jove文章详细。 </li></ol>

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	<li>Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).</li><li>Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-lymphocyte-associated+antigen-4+blockage+can+induce+autoimmune+hypophysitis+in+patients+with+metastatic+melanoma+and+renal+cancer.">Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer.</a> J Immunother. 28, 593-598 (2005).</li><li>Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+Hypophysitis+of+SJL+mice:+Clinical+Insights+from+a+New+Animal+Model.">Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model.</a> Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).</li><li>Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+hypophysitis+and+Hashimoto's+disease+in+a+woman.">Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman.</a> J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).</li><li>Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+hypophysitis:+an+underestimated+disease+in+search+of+its+autoantigen(s).">Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s).</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).</li></ol>

尽管自身免疫性垂体炎的第一个病人是在1962 年第4期报道，垂体自身抗原的致病性仍有待确定5。动物模型是非常有用的，以确定这些自身抗原的，协助的生物标志物，是可翻译的病人护理的发现。本文演示了一个简单的程序，准备在垂体蛋白质的形式，在实验动物诱发自身免疫性垂体炎是足够的。

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		<tr>
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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>15-ml Falcon tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>homogenization buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>phosphate buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polytron homogenizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BCA assay</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>23225</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete Freund's Adjuvant (CFA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F-5881</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mycobacterium tuberculosis</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>231141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2.5 mL Hamilton gastight syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22-gauge micro-emulsifying needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis

自身免疫性垂体炎是一种慢性炎症引起或伴随着自身免疫 1的脑下垂体。它历来被认为是一种罕见的疾病，但报告已在近年来显着增加。垂体炎，事实上，发展不寻常在块上，如CTLA - 4和PD - 1受体的T淋巴细胞，表达抑制性受体与抗体治疗癌症患者的一个“副作用“。实验小鼠注射佐剂3混合垂体蛋白质可诱发自身免疫性垂体炎。在这个视频文章中，我们演示了如何从鼠标脑垂体和如何准备他们在适合SJL小鼠诱导的自身免疫性垂体炎的形式提取的蛋白质。

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Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

可以复制自身免疫性垂体炎在小鼠体内，小鼠垂体蛋白提取物注射。

鼠标垂体免疫原的制备诱导实验性自身免疫性垂体炎

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.4K 次观看.  The Johns Hopkins University. 可以复制自身免疫性垂体炎在小鼠体内，小鼠垂体蛋白提取物注射。