作者希望认识到，发展援助和进行免疫组化米歇尔巴内斯的技术援助以及佩特里 - 汉森博士，博士鳗鱼和Timothy Brown评论。该项目是由美国农业部（USDA）CRIS项目＃MISV - 0801310和密西西比州立大学兽医学院。

<html> 1。细菌的挑战<ol><li>细菌在一夜之间成长为30 ° C摇脑心浸液肉汤。 </li><li>停止在鱼缸水的循环和添加肉汤100 1浓度（每升10毫升，例如）。 </li><li>一小时后孵化，在坦克重新启动的循环水，其余的细菌冲洗出来。 </li></ol> 2。采样<ol><li>采样时间和器官取决于研究的目的，但在我们的研究中，我们使用以下采样点：1，6，16，24，36，48，60，72，96，110，125和175小时后感染。 </li><li>在每一个时间点，安乐死六个鱼浸泡在水含MS222和样品（采样机关的选择是对什么是已知的感染过程中的）以下机关：鳃，沿侧线，肠，脾后的肌肉，肝，胃，心，头肾和躯干肾。 </li><li>采样后，立即组织学磁带加载机关和两个小时在1％福尔马林浸泡。 </li><li>固定两个小时后，从福尔马林50％的乙醇，在那里，直到嵌入保持磁带转移。 </li><li>石蜡嵌入机关通宵使用纸巾- Tek的贵宾3000组织的处理器（樱花TEK，托兰斯，加利福尼亚州）和部分在5μm的，使用了Leica RM2255 microtone（徕卡显微系统，班诺克本，伊利诺斯州）。 </li></ol> 3。切片脱蜡<ol><li>沉浸在明确的仪式，让所有的蜡溶解约5分钟，一个充满染色槽部分。电梯机架和排出多余的蜡溶剂。 </li><li>沉浸在一个明确的仪式5分钟，第二个容器的部分。经过几次的使用，取代溶剂之间的第一和第二的容器中的第一个容器和备用。 </li><li>沉浸在100％的酒精部分，除去蜡溶剂。 </li><li>沉浸在第二个100％的酒精槽部分。 </li><li>浸入70％的酒精槽部分。 </li><li>沉浸在运行的自来水，消除酒精的所有痕迹的章节。 </li></ol> 4。缓冲液的制备<ol><li>准备磷酸盐缓冲生理盐水溶解到1公升的蒸馏水和pH值8.0 g氯化钠，氯化钾0.2克，1.15克钠2 HPO 4和0.2克的KH 2 PO 4至7.4 。 </li><li> PBS稀释到0.9倍，加入900毫升的PBS到100毫升的蒸馏水。 </li><li>准备阻止加入2毫升小鼠血清的血清200μLTRITON - X 100和500μLBSA的50毫升的0.9倍PBS。 </li><li>准备50 mM的碳酸氢盐缓冲液是由溶解在500毫升蒸馏水H 2 O 2.1克碳酸氢钠3和4 g氯化钠和滴定，pH值8.2准备。 </li></ol> 5。 Immunhistochemistry <ol><li>补充水分在0.9倍PBS浸泡的部分。 </li><li>孵育30分钟，在阻断血清的幻灯片。 </li><li>孵育Ed9（100阻断血清稀释1）在一个不透明的湿盒内室温两小时的部分。 </li><li>冲洗部分PBS中4次，每次10分钟。 </li><li>在一个不透明的湿盒内室温孵育50μL二次抗体（羊抗鼠FITC标记的抗体，阻止血清稀释500倍）在两小时的部分。 </li><li>冲洗部分缓冲液中的碳酸氢盐的3倍。 </li><li>在去离子水冲洗部分简要。 </li></ol> 6。安装<ol><li>离开幻灯片，在黑暗中干燥几分钟。 </li><li>安装使用permafluor。 </li><li>安装介质来过夜，在黑暗阴凉的环境中，干燥，优先许可。 </li></ol> 7。显微镜<ol><li>组织切片观察，荧光显微镜下。在我们的实验中，我们使用奥林巴斯BX51显微镜配备了三重（FITC; MCA得克萨斯红）过滤器。相框软件（MicroFire，Goleta，加利福尼亚州）。 </li></ol> 8。代表性的成果： 由于鱼组织的自体荧光是如此之高，这些组织会出现下脐橙的三滤，方便地提供了一个细菌的背景。 在此背景下，个体FITC染色细菌会出现明亮的绿色圆点，在200X棒状将识别（图1）。 坏的部分，可以构成假阳性（由于在冲洗阶段的问题），在这种情况下，会出现大量的细菌统一目前在幻灯片上。 <img src="/files/ftp_upload/2687/2687fig1.jpg" alt="图1"/> 图1一块肌肉的显微照片显示两个五部分。 ictaluri（箭头A和B）（200X）。 igure 2“/&gt; 图2实验的总体方案 。

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	<li>Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).</li><li>Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish Pathology. , (2001).</li><li>Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Louisiana State University. , (1997).</li><li>Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+35S-Labeled+Edwardsiella+ictaluri+into+Channel+Catfish.">Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish.</a> Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).</li><li>Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+bioluminescent+Edwardsiella+ictaluri+for+noninvasive+disease+monitoring.">Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring.</a> FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).</li><li>Miyazaki, T., Plumb, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Edwardsiella+ictaluri+in+channel+catfish,+Ictalurus+punctatus+(Rafinesque).">Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque).</a> Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).</li><li>Areechon, N., Plumb, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Edwardsiella+ictaluri+in+Channel+Catfish,+Ictalurus+punctatus.">Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus.</a> Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).</li><li>Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Edwardsiella+ictaluri.">Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri.</a> Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).</li><li>Thune, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signature-Tagged+Mutagenesis+of+Edwardsiella+ictaluri+Identifies+Virulence-Related+Genes,+Including+a+Salmonella+Pathogenicity+Island+2+Class+of+Type+III+Secretion+Systems.">Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).</li><li>Karsi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+bioluminescence+mutant+screening+strategy+for+identification+of+bacterial+virulence+genes.">High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).</li><li>Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).</li><li>Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+monoclonal+antibodies+in+the+indirect+fluorescent+antibody+technique+(IFA)+for+the+diagnosis+of+Edwardsiella+ictaluri.">Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri.</a> Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).</li></ol>

该协议的细节在组织切片中的鲶鱼病原体爱德华ictaluri原位可视化技术。据我们所知，这是描述的第一个此类协议。 最关键的一步，在我们的经验，是在作为本议定书不足洗涤步骤4.4中所述的抗体冲洗，可能会导致假阳性。 这项技术的结果与解释的主要问题是组织的自体荧光。然而，人们发现，使用三滤，主要是解决问题的非特异性荧光绝?...

<table border="1"><tbody><tr><th>试剂名称</th><th>公司</th><th>目录编号</th></tr><tr><td>脑灌注液</td><td>碧迪</td><td> 237200 </td></tr><tr><td> MS222 </td><td>银色实验室</td><td></td></tr><tr><td>全小鼠血清</td><td> Cappel </td><td> 55989 </td></tr><tr><td>羊抗小鼠FITC </td><td>南方生物技术</td><td> 1010年至1004年</td></tr><tr><td> Permafluor </td><td>实验室的愿景</td><td> TA - 030 - FM </td></tr><tr><td>氯化钾（KCl） </td><td>西格玛</td><td> P - 4504 </td></tr><tr><td> TRITON - X </td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> X100 - 6X500ML </td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>西格玛</td><td> 85040C </td></tr><tr><td>磷酸钾（KH 2 PO 4） </td><td>西格玛</td><td> P - 5379 </td></tr><tr><td>小苏打（碳酸氢钠3） </td><td>西格玛</td><td> S - 5761 </td></tr><tr><td>氯化钠（NaCal） </td><td>西格玛</td><td> S - 9625 </td></tr><tr><td>钠磷酸氢二钠（以Na 2 HPO 4） </td><td>西格玛</td><td> S - 9390 </td></tr></tbody></table>

use of fluorescent immuno-chemistry for the detection of edwardsiella ictaluri in channel catfish (i. punctatus) samples

虽然爱德华ictaluri是斑点叉尾鮰毛虫的主要病原体，并已发现了近三十年前 1,2，到目前为止，这些作者的知识，没有方法已发展到允许在原位可视化细菌在组织学切片。 虽然细菌的本地化已在以前的研究使用 3，辐射标记 4平板计数，或发光细菌体内确定，这些研究大多只进行总值器官水平，但有一个例外 6 。此限制的特别关注，是因为大肠杆菌ictaluri有一个复杂的感染周期1,7，和它具有的各种致病因素8,9。 E.复杂的相互作用与它的主机ictaluri是在许多方面类似伤寒沙门氏菌10，这是在同一分类家庭。 在这里，我们描述的一种技术，允许检测细菌用间接免疫组织化学，使用单克隆Ed9抗体安斯沃思等11。 简单地说，一个封闭血清应用于石蜡包埋组织切片，以防止非特定招标。然后，部分孵育与初级抗体：E. ictaluri特异性单克隆抗体Ed9。多余的抗体冲洗，加入FITC标记的抗体。冲洗后，部分安装带有荧光的具体安装介质。 这使得对大肠杆菌的检测ictaluri鮰组织的组织切片原位。

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Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

在这里，我们描述了一个程序，允许标签<em爱德华ictaluri原位</em在斑点叉尾鮰的组织切片<em&gt;斑点叉尾毛虫</em&gt;作为一个小学，和荧光FITC标记抗体作为辅助用单克隆抗体间接免疫组化Ed9。这允许使用荧光显微镜观察细菌的检测。

使用荧光免疫化学检测爱德华ictaluri</em斑点叉尾鮰>（一毛虫）样品

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

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使用荧光免疫化学检测爱德华ictaluri（一毛虫）样品