反向转录循环介导的等温放大（RT-LAMP）测定，用于对罗非鱼湖病毒进行特定和快速检测

罗非鱼湖病毒是一种新出现的病毒和传染性病原体，在罗非鱼及其杂交物种中导致高死亡率。由于罗非鱼是许多发展中国家的主要蛋白质来源，新的病毒感染对罗非鱼养殖产生了巨大影响，也威胁着世界粮食安全。开发一种快速、准确、灵敏的检测鱼组织病毒的方法，将有助于疾病控制，减少病毒的影响。

在这段视频中，我们将展示逆转录环中位等温扩增，或RT-LAMP检测，用于在鱼样本中快速检测罗非鱼湖病毒。第二部分，RNA提取。首先，将3250毫克的肝组织加入无菌的1.5毫升微离心管中，含有600至1000微升酸瓜尼丁酚基试剂，并薄荷直到均质。

在10，000 RCF下离心30秒，然后将上一代转移到一个新的管子中。将95%乙醇的等量加入管中，彻底混合。将溶液转移到旋转柱中，放入收集管中，然后在10，000 RCF下离心30秒。

丢弃流经，将柱转移到新的收集管中。将400微升RNA PreWash加入柱中，以10，000 RCF离心30秒。放弃流式，然后重复此步骤。

将700微升RNA洗涤缓冲液加入柱，以10，000 RCF离心两分钟。之后，将柱转移到无菌的1.5毫升微离心管中。最后，用100微升、无核酸酶水将RNA放入柱基中，并在10000 RCF下离心30秒。

第三部分，底首相设计。PrimerExplorer 版本 4 是用于设计高效 LAMP 或 RT-LAMP 底头笔的最常用生物信息学工具，其网站上提供了软件的手册。在这里，四个特定的底因，由两个内部和两个外部底向，旨在识别六个不同的区域，在部分3的TiLV，起源于泰国。

进入视频中显示的链接网站后，单击 PrimerExplorer V4。选择包含 TiLV 段 3 序列的文件，采用 FASTA 格式，从 GenBank 访问的数字 KX631923 或罗非鱼湖病毒 TV1 段 3 检索，然后单击底图设计按钮。单击"生成"按钮后，软件将进行处理，结果将显示。在优化了LAML放大序列后，总共为本研究选择了一对外部底转和两对内部底转，以检测TiLV感染。

此处显示了这组底向。第四部分，RT-LAMP的演示。专用于罗非鱼湖病毒的RT-LAMP主混合物，由以下化学品组成。

使用表中显示的化学品准备主混合物。将 22 微升主混合剂分配到无菌 1.5 毫升微离心管中。然后，将RNA模板的三微升加入反应管。

对于负对，使用蒸馏水代替RNA材料，并很好地混合。在65摄氏度下孵育反应60分钟，随后在80摄氏度下孵育10分钟。孵育30分钟后，肉眼可以直观地观察热量变化。

在适当时，我们可以确认RT-LAMP的测定结果，在1.5%的阿加罗斯凝胶上执行凝胶电泳，以100伏特常数运行40分钟，从而将1千基对分子大小的DNA梯子作为标记加载，以确定片段大小。第五部分，具有代表性的结果和解释。经过30分钟的孵育，在365纳米波长的紫外光下，在受感染的样品中明显观察到了TiLV的阳性放大反应，而负对照的颗粒荧光反应则具有明显且略带无色溶液。

相应地，在阿加罗斯凝胶电泳上确认了RT-LAMP产品的放大，显示了倒置DNA重复的多重放大的各种尺寸，在TiLV感染的样品中形成UV灯下的干环结构，而阴性控制井中没有显示带，其结果与RT-LAMP测定的结果一致。因此，要减少罗非鱼湖病毒的传播，立即筛选这些受感染的鱼类，使用有效的诊断方法，是重要的关键之一。因此，新开发的RT-LAMP检测应提供一种快速、灵敏的诊断工具，用于生物安全措施。

测定可用于实验室或现场设施。我们希望，将实施这种方法，以筛查受感染的鱼类种群，这可能导致罗非鱼湖病毒的传播减少。