Os autores desejam reconhecer a assistência técnica da Banes Michelle, assim como Dr. Petrie-Hanson Eels, Dr. Timothy Brown e por sua assistência em desenvolvimento e realização da imuno-histoquímica. Este projeto foi financiado pelo USDA CRIS projeto # MISV-0801310 e pela Mississippi State University College of Veterinary Medicine.

<html> 1. Desafio bacteriana <ol><li> Bactérias crescem durante a noite a 30 ° C em agitação caldo cérebro-coração. </li><li> Parar a circulação da água nos tanques de peixe e adicione o caldo na concentração de 1 em 100 (10 ml por litro, por exemplo). </li><li> Após uma hora de incubação, reinicie circulação de água nos tanques para lavar as bactérias remanescentes. </li></ol> 2. Amostragem <ol><li> Tempos de amostragem e órgãos depende do objectivo do estudo, mas em nosso estudo, foram utilizados os pontos de amostragem: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 e 175 horas pós-infecção . </li><li> Pontos em cada tempo, euthanize seis peixes por imersão em água contendo MS222 e amostra os seguintes órgãos (seleção dos órgãos amostrados foi baseado no que é conhecido do processo de infecção): brânquias, músculos posteriores ao longo da linha lateral, intestino, baço, estômago, fígado, coração, rins, cabeça, tronco e rim. </li><li> Após a amostragem, imediatamente os órgãos de carga em cassetes histológicos e mergulha-as por duas horas em 1% de formol. </li><li> Após duas horas de fixação, a transferência das cassetes de formol a 50% de etanol, onde permanecem até a incorporação. </li><li> Parafina incorporar órgãos durante a noite usando um lenço de papel-Tek VIP processador de tecido 3000 (Sakura Tek, Torrance, Califórnia) e na seção de 5m usando uma Leica RM2255 microtone (Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois). </li></ol> 3. Seções desparafinação <ol><li> Mergulhe as seções em um cocho cheio de coloração clara de rito para cerca de 5 minutos para permitir toda a cera para dissolver. Levante a prateleira e drenar o excesso de cera solvente. </li><li> Mergulhe as seções em um segundo recipiente de clara de rito por 5 minutos. Depois de alguns usos, substituir o solvente no recipiente de primeira e alternar entre os recipientes de primeiro e segundo. </li><li> Mergulhe as seções em álcool 100% para remover a cera solvente. </li><li> Mergulhe as seções em um cocho de segundo de álcool a 100%. </li><li> Mergulhe as seções em uma calha de álcool 70%. </li><li> Mergulhe as seções em água corrente para remover todos os vestígios de álcool. </li></ol> 4. Preparação de tampão <ol><li> Prepare tampão fosfato salina por dissolução de 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na 2 HPO 4 e 0,2 g KH 2 PO 4 em 1 litro de água destilada e pH para 7,4. </li><li> Diluir PBS para 0.9x, adicionando 900 ml de PBS e 100 ml de água destilada. </li><li> Prepare bloqueio soro adicionando 2 ml de soro do mouse; 200 mL Triton X-100 e 500 mL BSA a 50 ml de 0.9x PBS. </li><li> Prepare 50 mM Buffered Saline Bicarbonato é preparada dissolvendo 2,1 g NaHCO 3 e 4 g de NaCl em 500 ml H 2 O destilada e titulada até pH 8.2. </li></ol> 5. Immunhistochemistry <ol><li> Reidratar seções por imersão em 0.9x PBS. </li><li> Incubar as lâminas por 30 minutos no bloqueio de soro. </li><li> Incubar seções Ed9 (diluída 1 em 100 no soro bloqueio) por duas horas em uma câmara úmida opaca à temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe seções 4 vezes em PBS por 10 minutos cada. </li><li> Incubar seções por duas horas em 50 ul do anticorpo secundário (cabra anticorpos anti rato FITC; diluídas 500 vezes no bloqueio de soro) em uma câmara úmida opaca à temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe seções 3 vezes em solução salina de bicarbonato. </li><li> Enxágüe seções brevemente em água deionizada. </li></ol> 6. Montagem <ol><li> Deixe os slides para secar na escuridão por alguns minutos. </li><li> A montagem é realizada utilizando permafluor. </li><li> Deixar o meio de montagem para secar, preferencialmente durante a noite, em um ambiente escuro e fresco. </li></ol> 7. Microscópio <ol><li> Cortes histológicos estão prontos para observar em um microscópio fluorescente. Em nosso experimento, usamos uma Olympus BX51 microscópio equipado com um triplo (FITC; MCA-Texas Red) filtro. O software Picture Frame (MicroFire, Goleta, Califórnia) foi utilizado. </li></ol> 8. Resultados representativos: Porque a auto-fluorescência de tecidos de peixes é tão alta, estes tecidos aparecerá laranja sob o Tri-filtro, convenientemente fornecendo um fundo para as bactérias. Neste contexto, o indivíduo FITC bactérias coradas vai aparecer como pontos verdes brilhantes e, ao 200X sua forma vara será reconhecível (Fig. 1). Seções ruim pode constituir falsos positivos (devido a um problema na fase de enxaguamento), caso em que um grande número de bactérias parecem estar presentes de maneira uniforme no slide. <img src="/files/ftp_upload/2687/2687fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Micrografia de um músculo mostrando duas seções E. ictaluri (setas a e b) (200x). IGURA 2 &quot;/&gt; Figura 2. Esquema geral do experimento

<ol>
	<li>Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).</li><li>Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fish Pathology. , (2001).</li><li>Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Louisiana State University. , (1997).</li><li>Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entry+of+35S-Labeled+Edwardsiella+ictaluri+into+Channel+Catfish.">Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish.</a> Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).</li><li>Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+bioluminescent+Edwardsiella+ictaluri+for+noninvasive+disease+monitoring.">Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring.</a> FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).</li><li>Miyazaki, T., Plumb, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+Edwardsiella+ictaluri+in+channel+catfish,+Ictalurus+punctatus+(Rafinesque).">Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque).</a> Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).</li><li>Areechon, N., Plumb, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Edwardsiella+ictaluri+in+Channel+Catfish,+Ictalurus+punctatus.">Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus.</a> Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).</li><li>Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Edwardsiella+ictaluri.">Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri.</a> Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).</li><li>Thune, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signature-Tagged+Mutagenesis+of+Edwardsiella+ictaluri+Identifies+Virulence-Related+Genes,+Including+a+Salmonella+Pathogenicity+Island+2+Class+of+Type+III+Secretion+Systems.">Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).</li><li>Karsi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+bioluminescence+mutant+screening+strategy+for+identification+of+bacterial+virulence+genes.">High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).</li><li>Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).</li><li>Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+monoclonal+antibodies+in+the+indirect+fluorescent+antibody+technique+(IFA)+for+the+diagnosis+of+Edwardsiella+ictaluri.">Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri.</a> Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo de detalhes de uma técnica para a visualização em situ do bagre patógeno Edwardsiella ictaluri em cortes histológicos. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro protocolo, tais descrito. O passo mais crítico, em nossa experiência, é a lavagem dos anticorpos, tal como descrito no passo 4.4 do presente protocolo como a lavagem insuficiente pode resultar em falso positivo. O principal problema com interpretação dos...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Caldo cérebro </td><td> Becton Dickinson </td><td> 237200 </td></tr><tr><td> MS222 </td><td> Argent Labs </td><td></td></tr><tr><td> Soro do mouse toda </td><td> Cappel </td><td> 55989 </td></tr><tr><td> Cabra anti-rato-FITC </td><td> Sul Biotech </td><td> 1010-1004 </td></tr><tr><td> Permafluor </td><td> Laboratório de Visão </td><td> Ta-030-FM </td></tr><tr><td> Cloreto de potássio (KCl) </td><td> Sigma </td><td> P-4504 </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 6X500ML- </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma </td><td> 85040C </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio (KH 2 PO 4) </td><td> Sigma </td><td> P-5379 </td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio (NaHCO 3) </td><td> Sigma </td><td> S-5761 </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (Nacala) </td><td> Sigma </td><td> S-9625 </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio dibásico (Na 2 HPO 4) </td><td> Sigma </td><td> S-9390 </td></tr></tbody></table>

use of fluorescent immuno-chemistry for the detection of edwardsiella ictaluri in channel catfish (i. punctatus) samples

Enquanto Edwardsiella ictaluri é um importante patógeno do canal catfish Ictalurus punctatus e foi descoberto há quase três décadas 1,2, até agora, a melhor do conhecimento desses autores, nenhum método foi desenvolvido para permitir a visualização em situ do bactérias em cortes histológicos. Enquanto a localização bacteriana foi determinada in vivo em estudos anteriores usando contagem placa 3, 4 radiométrica rotulados ou bactérias bioluminescentes 5, a maioria destes estudos só foram realizados ao nível de órgãos bruto, com uma exceção 6. Esta limitação é particularmente preocupante porque E. ictaluri tem um complexo ciclo de infecção 1,7, e tem uma variedade de fatores de virulência 8,9. A complexa interação de E. ictaluri com a sua variedade é semelhante em muitos aspectos, a Salmonella typhi 10, que está na mesma família taxonômica. Aqui nós descrevemos uma técnica que permite a detecção de bactérias usando indireta imuno-histoquímica, usando o anticorpo monoclonal Ed9 descrita por Ainsworth et al. 11. Resumidamente, um soro de bloqueio é aplicada a inclusão em parafina os cortes histológicos para prevenir não-específicas de licitação. Então, as seções são incubadas com o anticorpo primário: E. ictaluri anticorpo monoclonal específico Ed9. Anticorpos em excesso são lavados afastado eo FITC anticorpos secundários são adicionados. Após a lavagem, as seções são montadas com um meio específico fluorescentes de montagem. Isso permitiu a detecção de E. ictaluri in situ em cortes histológicos de tecidos bagre do canal.

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Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Aqui nós descrevemos um procedimento que permita a rotulagem de<em&gt; Edwardsiella ictaluri in situ</em&gt; Em cortes histológicos de bagre do canal<em&gt; Ictalurus punctatus</em&gt; Usando imunohistoquímica indireta com anticorpos monoclonais Ed9 como primária, e fluorescente FITC anticorpos rotulado como um secundário. Isso permitiu a detecção da bactéria por microscopia de fluorescência.

Uso de fluorescentes Imuno-Química para a detecção de Edwardsiella ictaluri Em bagre do canal ( I. punctatus) Amostras

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

10.4K visualizações.  Mississippi State University. Aqui nós descrevemos um procedimento que permita a rotulagem de Edwardsiella ictaluri in situ Em cortes histológicos de bagre do canal Ictalurus punctatus Usando imunohistoquímica indireta com anticorpos monoclonais Ed9 como primária, e fluorescente FITC anticorpos rotulado como um secundário. Isso permitiu a detecção da bactéria por microscopia de fluorescência.