增强的绿色荧光蛋白测定，用于研究原神经元的神经质生长

转染效率低是确定蛋白质如何重新激活原神经元中神经酸盐生长的主要障碍。我们的协议通过ERFP的共转感染来识别成功的转染细胞，克服了这个问题。EGFP和感兴趣的蛋白质的高共发率确保了测定的准确性。

因此，现在需要免疫荧光染色。由于神经性细胞在神经再生过程中出现，该方法可应用于确定脑损伤或神经退行性疾病中受损神经元网络的新靶点。在开始手术之前，将无菌的 18 毫米圆形盖玻片放入 12 孔组织培养板的每个孔中，并在加湿的 37 摄氏度培养箱中，将每毫米 5 微克的聚-D-Lysine 溶液涂上 5 微克，至少一小时。

在孵育结束时，吸进聚-D-Lysine溶液，并用无菌水冲洗盖玻片。在胚胎第18天，将从一只怀孕时分的斯普拉格·道利大鼠身上采集的子宫放入10厘米的培养皿中，用小解剖剪刀打开子宫和羊膜囊。使用剪刀去除胎盘，用钳子将整个胚胎移植到含有冰镇PBS葡萄糖的10厘米培养皿中。

用剪刀沿着头骨的缝合线切割，用一个小的扁平铲子将胚胎大脑转移到含有新鲜冰冷PBS葡萄糖的10厘米新的培养皿中。使用两个五号钳子和解剖显微镜，将两个脑半球从小脑和脑干分离，并切除脑膜。然后将皮层与脑半球分离，将皮层放在含有新鲜冰冷PBS葡萄糖的15毫升管中。

对于初级皮质神经元培养，在II类生物安全柜中，允许皮层在4摄氏度下由重力沉淀5分钟，然后用0.05%胰蛋白素EDTA取代PBS葡萄糖。与轻轻的敲击混合，在37摄氏度的水浴中孵育组织10分钟，每两分钟额外轻轻敲击一次。在孵化结束时，用四毫升的维持介质停止消化，并使用一毫升移液器通过温和的三角分离组织。

通过离心沉淀细胞，将颗粒重新悬浮在一毫升的维持介质中，进行第二次离心。在第二个离心后在一毫升新鲜维持介质中重新浓缩形成颗粒，以6.5倍10的浓度将分离的神经元镀到每厘米平方浓度为1毫升的维持介质中，在12井板中每井一毫升的维持介质中。在37摄氏度和5%的二氧化碳下两天后，将EGFP和靶向蛋白质粒DNA和转染试剂分两个独立的1.5毫升管中稀释，然后混合在一起。

通过将转染混合物添加到井中，用EGFP结构对细胞进行转染。24小时后，用37摄氏度的PBS清洗细胞，并在室温下用4%的甲醛在PBS中修复10分钟。在孵化结束时，每次洗涤用新鲜 PBS 清洗固定细胞三次，并将最小体积的荧光安装介质添加到每个样品的一个显微镜玻璃幻灯片上。

然后小心地将涂层盖玻片转移到安装介质上，样品朝向玻璃滑梯。要成像神经石生长，请在荧光显微镜上选择 40 倍的镜面，然后单击"开始"以捕获每个转染至少 40 个完整 EGFP 阳性神经元的图像。当所有神经素都已成像后，使用 NeuronJ 插件打开 ImageJ 中捕获的图像，并测量每个神经元从细胞体到生长锥顶的最长神经素的长度。

然后分析通过软件获得的数据，确定靶蛋白对神经土生长的影响。细胞茶素D抑制神经素延长在剂量依赖的方式，而神经素外生生长增强的神经元治疗神经生长因子。此外，与未转化的神经元相比，神经元生长适配器蛋白FE65显著刺激神经素的生长倍。

尽管转染效率较低，但免疫荧光分析显示，超过80%的两天细胞培养可以成功地与EGFP和FE65联合感染。EGFP表达在转染后6小时检测，而FE65在第12小时首次检测到，两个信号在转染后长达7天。不同数量的FE65质粒DNA的原发性大鼠皮质神经元的转染揭示了与0至0.5微克FE65质粒的neurite延长剂量依赖性增加。

然而，在通过0.5或1微克质粒转染的神经元中，没有显著的生长差异。在尝试该协议时，重要的是将适当的区域与胚胎大脑分离。该技术还可用于研究人类 iPSC 衍生神经元的神经生长，为再生医学提供了宝贵的工具。