利用时间分辨蛋白诱导的荧光增强来鉴定稳定的局部构象，一次一α-突触核蛋白单体

在研究蛋白质结构亚群和构象时，单分子，蛋白质诱导的荧光增强可以补充单分子FRET测量，特别是在不同的结构亚群报告稳定的局部结构的情况下。该技术的主要优点是，它根据染料标记位点到蛋白质表面的附近捕获不同的位点特异性结构亚群。单分子，蛋白质诱导的荧光增强可以应用于任何感兴趣的生物分子系统，以探测不同的，局部的，结构的亚群。

首先在低蛋白结合管的测量缓冲液中制备25皮摩尔磺酰磺酰-Cy3标记的α-突触核蛋白。将100微升每毫升1毫克BSA加入18腔显微镜盖玻片中并孵育一分钟，然后丢弃BSA。将100微升25皮摩尔磺酰基-Cy3标记的α-突触核蛋白样品加入盖玻片的腔室中。

接下来，对于数据采集，在高数值孔径水浸入物镜的顶部加入一滴超纯水，将盖玻片滑轨固定在载物台腔室中，然后将组件安装在显微镜载物台的顶部。将物镜向上提起，直到物镜顶部的水滴涂抹在盖板滑移的底部，然后打开激光快门。当物镜向上移动时，检查CCD相机上通风环的图案。

第一个环表示水/玻璃界面处的焦点，第二个环表示玻璃与样品溶液之间界面处的焦点。将物镜的高度增加75微米，使激光焦点深入溶液，以最大限度地减少盖子滑动玻璃表面的自发荧光。将物镜处的激光功率调谐约100微瓦。

在预定义的时间内开始采集检测到的光子。打开 Jupyter 笔记本，然后打开示例笔记本。加载 FRETBursts 和 Photon-HDF5 数据文件。

使用光子间时间的直方图来计算数据采集每30秒的背景速率。对于20个连续光子，一次移动一个光子的时间窗，如果瞬时光子速率F至少比数据采集期间的背景速率大11倍，则收集光子数据。计算突发中光子的大小和数量、突发持续时间、突发中最后一个光子和第一个光子检测时间之间的时间差、突发亮度、突发中瞬时光子速率的最大值、突发分离、连续突发之间的时间间隔。

将突发亮度值的直方图与事件轴以对数刻度绘制。将突发亮度阈值定义为直方图显示衰减图案的最小突发亮度值，并选择亮度值大于突发亮度阈值的突发。对于突发平均荧光寿命测量，绘制所选突发中所有光子的光子纳米时间直方图，光子计数轴以对数刻度表示。

将纳米时间阈值定义为光子纳米时间直方图表现出衰减模式的最小纳米时间值。仅选择纳米时间大于纳米时间阈值的光子。计算所有选定光子纳时的代数平均值。

从光子纳米时间代数平均值中减去纳米时间阈值。得到的值是脉冲串的平均光子纳米时间，与平均荧光寿命成正比。绘制所有突发平均荧光寿命的直方图。

可能出现荧光寿命的中心分布亚群。具有较低值平均值的亚群代表Sulfo-Cy3未被空间阻滞的分子物种，而具有较高值平均值的亚群代表具有S-Cy3的分子物种，这些分子物种受到空间阻滞更多。对于慢速、突发间动力学评估，使用对数刻度的分离时间轴绘制突发分离时间的直方图。

选择此选项可保存所有连续爆发对，这些脉冲串的间隔时间小于定义相同分子亚群的最大分离时间。绘制低于特定分离时间阈值的所有突发对的第一和第二脉冲的平均荧光寿命的直方图或散点图。单个S-Cy3标记的α-突触核蛋白-56分子的平均荧光寿命的直方图显示，第一亚群具有1.6纳秒的特征荧光寿命，并且代表α-突触核蛋白构象状态，残基56附近几乎没有蛋白质表面。

第二亚群具有3.5纳秒的特征荧光寿命，代表α-突触核蛋白构象状态，在残基56附近具有更多的蛋白质表面。已知α-突触核蛋白分子的非淀粉样蛋白β组分片段在与SDS囊泡结合时采用螺旋，发夹结构，这被证实为单一荧光寿命群体，其特征寿命约为3纳秒，并且没有具有1.6纳秒特征寿命的亚群。连续的单分子爆发之间的分离时间直方图报告了分离时间快于100毫秒的重复分子，其中第一次和第二次爆发来自同一分子。

所有单分子突增的平均荧光寿命直方图显示亚群具有较短的特征寿命，以及具有较长的特征寿命，这表明单个分子可以在不同平均寿命值之间经历比爆发持续时间更慢的转变。在最多100毫秒的突发分离时间内，有一小部分分子从短寿命亚群中的第一次爆发开始，并在长寿命亚群中作为第二次爆发重复出现。虽然分子的比例从长寿命亚群中的第一次爆发开始，并在短寿命种群中作为第二次爆发重复出现，但表明两个亚群之间的转变在10到100毫秒内。

分析实验结果时要记住的最重要的事情是从背景中正确分离单分子荧光信号，并分析具有足够光子纳时的突发。smPIFE的发展为研究人员在单分子水平上探索核酸蛋白相互作用铺平了道路。这一进步为研究蛋白质中的局部结构动力学奠定了基础。