作者要感谢路易斯·德尔加迪略先生（俄亥俄大学化学和生物分子工程系）、马修·威廉斯先生（俄亥俄大学化学和生物分子工程系）和菲利伯托·塞德诺-劳伦特博士（布里格姆妇女医院和哈佛医学院）提供专家技术援助。作者还要感谢2011年冬季CHE 404/BME 504和2012年秋季CHE 4830/BME 5830学生（俄亥俄州大学化学和生物分子工程和生物医学工程系）的技术咨询和讨论。这项工作得到了国家科学基金会（NSF）主要研究仪器赠款CBET-1039869（MMB）、NSF CBET-1106118（MMB）、皮肤病基金会研究补助金A050422（SRB）、国家卫生研究院（NIH）NCI赠款1R15CA161的支持 830-01 （MMB）， NIH 基尔希斯坦-NRSA 博士后奖学金 F32CA14219-01A1 （SRB）， NIH/NCI R01CA173610 （CJD） 和 NIH NCCAM 授予 R01AT004628 （CJD）。

1. 验证蛋白质 A 的亲和力
<ol><li>验证 Fc 表达蛋白（重组融合蛋白或 IgG 抗体， 以下简称"蛋白质"）在使用蛋白A膜吸入器之前，对蛋白质A14-17 具有可接受的亲和力，并测试蛋白质在库存溶液中的存在（例如 ，通过离心在1，000 x g中澄清的细胞培养超纳特，5分钟到颗粒悬浮细胞）。使用流细胞测量、西印、ELISA 等。根据实验室偏好检测 Fc 的蛋白质功能和/或存在。理想情况下，量化细胞培养超自然（第6步）中的蛋白质，以避免超过蛋白质A膜增聚能力。如果检测到蛋白质，则继续。</li>
</ol>2. 准备蛋白质膜增发剂和细胞培养超自然
<ol><li>按照制造商的说明准备膜吸食器。 切勿让空气进入膜沉着器。通过膜吸食器灌注的所有溶液应在室温下使用 0.22 μm 过滤器进行预过滤。 用 0.22μm 过滤的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 或选择的缓冲液填充 10 毫升注射器，并释放气泡。香水 DPBS 以去除存储解决方案，并在使用前立即平衡膜增压器。</li>
	<li>使用真空驱动的 0.22μm 无菌过滤装置，在灌注前立即通过膜吸附器过滤细胞培养超自然物。</li>
</ol>3. 加载蛋白质膜增发器
<ol><li>将细胞培养超自然物吸进 Luer Lock 注射器（30 毫升或更大），并释放任何气泡。</li>
	<li>组装材料和设备，如 图1所示。将注射器连接到膜吸食器的入口。将柔性管连接到膜吸食器插座上。如有必要，在注射器和膜吸食器之间放置一个 0.22μm 注射器过滤器。使用烧瓶或瓶子从吸食者处捕获流经（也称为过滤）。</li>
	<li>将注射器泵设置为所需的体积流量，但不超过制造商推荐的流量（例如 10 毫升/分钟）。通过膜增压器将细胞培养超自然体灌注，收集通过烧杯或其他容器的流量。将注射器重新装上所需的超标剂。</li>
	<li>如果需要，使用流动细胞测量、西印、ELISA 等测试蛋白质的流动。基于实验室偏好。通常没有必要反驳流过的流程。</li>
</ol>4. 膜除胶器中的埃卢特蛋白
<ol><li>用 10 毫升 DPBS 清洗膜吸食器，以去除任何非绑定蛋白。</li>
	<li>使用 10-15 毫升的洗涤缓冲器（例如基于胺的洗涤缓冲器（pH 2.8）时，以所需的流速（例如1 毫升/分钟）从膜吸食器中提取的 Elute 蛋白质。在含有中和缓冲器（例如1 M Tris （pH 9.4） 的管中捕获提升，其容量为 10%（1.0-1.5 毫升）。</li>
	<li>或者，将一毫升增量中的蛋白质放入含有 100 μl 中和缓冲液的管中，使用总容量为 10-15 毫升的洗脱缓冲器。使用首选的表征方法测试每个分数中蛋白质的存在。</li>
	<li>根据制造商的说明再生膜沉着器。香水 10 毫升 0.22 μm 过滤 DPBS 或选择缓冲区，然后 10 毫升 0.22 μm 过滤 50 m NaOH 在 1 N NaCl，最后 10 毫升 0.22 μm 过滤 DPBS。在 DPBS 中填充膜吸食器，在 DPBS 中填充 20% 乙醇，以在 4 oC 下进行长期存储。</li>
</ol>5. 浓缩和透析蛋白质
<ol><li>将所有高放（或在第 4.3 步确定的含有蛋白质的浓缩分数）沉积在 10 kDa 分子重量截断离心滤清器单元中。按照制造商的离心指示操作。</li>
	<li>按照制造商的说明，在小容量透析单元（10 kDa 分子重量切断）中对选择的缓冲区进行透析。如果蛋白质沉淀是一个问题，则可能需要在透析材料中添加缓冲区。如果需要，透析材料可以冷藏，直到第 6 步可以执行，但不建议长期存储，不含防腐剂。</li>
</ol>6. 在快速的西方膨胀程序中量化和描述纯化产品
<ol><li>在18-20的减少或不降低条件下，通过 SDS-PAGE 在选择的凝胶上解决纯化蛋白和 Fc 标准。使用迷你凝胶而不是米迪凝胶，以尽量减少运行时间。<ol>
<li>如果尚不为人知，则确定 Fc 标准范围，在加载量（例如 0.1-1 毫克）方面，波段信号的线性变化。使用相同的凝胶、运行条件、转移条件和试剂，用于量化和描述纯化蛋白质。</li>
			<li>加载多种纯化蛋白样本，包括用 DPBS 稀释的样品，以确保纯化蛋白带信号在图像分析中 Fc 标准的线性信号范围内。</li>
		</ol>
</li>
	<li>按照blotter制造商的指示，使用半膨胀的13将蛋白质从凝胶转移到不连续缓冲系统中的聚乙烯氟化物（PVDF）膜。传输时间通常为 5-10 分钟。如有需要，库马西在转移后弄脏凝胶，以验证转移效率21。</li>
	<li>使用真空辅助蛋白检测系统，根据实验室偏好，使用碱性磷酸酶 （AP） 或马萝卜过氧化酶 （HRP） 进行与抗 Fc 或抗 IgG 结合的免疫凝血。免疫印迹时间通常小于1小时。</li>
	<li>使用选择的基板和方法（如 AP基板和增强的化疗）开发免疫体。</li>
	<li>通过图像分析量化纯化蛋白。在来自 Fc 标准的波段信号上执行线性回归。如果 R2>0.90，则使用该线的方程计算其波段信号中的蛋白质数量。如有必要，考虑样品稀释。由于蛋白质的定量是在Fc的基础上进行的，调整蛋白质和Fc之间的分子重量差异值。 如果R2<0.90，则重复整个步骤6。</li>
	<li>使用功能检测或方法验证蛋白质，通过流动细胞测量、西斑、ELISA 等检测 Fc 。基于实验室偏好。</li>
	<li>将蛋白质稀释到所需的浓度和/或在纯化蛋白溶液中加入任何所需的防腐剂或稳定剂，然后再进行长期储存、冷冻或其他补充。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gagnon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+trends+in+antibody+purification.">Technology trends in antibody purification.</a> J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).</li><li>Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioseparation+in+antibody+manufacturing:+The+good,+the+bad+and+the+ugly.">Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly.</a> Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).</li><li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production.">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2, 480-499 (2010).</li><li>Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+antibody+purification.">Future of antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. 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Pap. 62, 458-463 (2008).</li><li>Lauriere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semidry+electroblotting+system+efficiently+transfers+both+high-+and+low-molecular-weight+proteins+separated+by+sds-page.">A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page.</a> Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).</li><li>Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+antibodies+using+affinity+chromatography.">Purification of antibodies using affinity chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).</li><li>Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+a+from+staphylococcus+aureus.+Its+isolation+by+affinity+chromatography+and+its+use+as+an+immunosorbent+for+isolation+of+immunoglobulins.">Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins.</a> FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).</li><li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+a+chromatography+for+antibody+purification.">Protein a chromatography for antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).</li><li>Kronvall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surface+component+in+group+a,+c,+and+g+streptococci+with+non-immune+reactivity+for+immunoglobulin+g.">A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g.</a> J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).</li><li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+nascent+galectin-1+chimeric+molecule+for+studying+the+role+of+leukocyte+galectin-1+ligands+and+immune+disease+modulation.">Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation.</a> J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+t4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+Procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Coomassie+brilliant+blue+g250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrylamide+gels.">The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+inhibition+of+galectin-1-binding+carbohydrates+accentuates+antitumor+immunity.">Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer.">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), (2009).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay.">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> J. Vis. Exp. (38), (2010).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analyses+of+all+Influenza+Type+A+Viral+Hemagglutinins+and+Neuraminidases+using+Universal+Antibodies+in+Simple+Slot+Blot+Assays.">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.</a> J. Vis. Exp. (50), (2011).</li></ol>

没有什么可透露的。

此处描述的协议旨在快速分离和描述表达人类 Fc （Gal-1hFc） 的奇美融合蛋白，同时不会显著影响产品回收或膨胀成本。流线型工作流程的关键组件是用于隔离的蛋白质 A 膜吸附剂，以及用于西式印迹特征的半干转移和真空辅助免疫印迹。
Gal-1hFc 的隔离和特征处理时间从 300 毫升细胞培养超纳特（流线型协议中大约 9 小时，而传统协议中为 20 小时以上）的处理时间的急剧下降?...

使用蛋白质 A 亲和色谱法可以分离来自细胞培养超纳特和稀释裂解细胞溶液的抗体和重组蛋白表达免疫球蛋白 G （IgG） Fc 片段。在基础科学和工程实验室和工业领域，尽管成本高，加工时间长1-3，但富含多孔蛋白A涂层糖、玻璃或聚合物珠子的柱子最常用于亲和色谱。众所周知，亲和色谱是实验室和工业环境中最大的费用和处理瓶颈。因此，为了降低成本和加工时间，在不牺牲从工艺列车1，2，5-7的整体产品回收方面，已经进行了许多改进。抗体和其他Fc表达蛋白的分离特别有希望的是使用蛋白质A膜吸收剂2，5，7-10的亲和色谱。而柱色谱中的 Fc 捕获是扩散限制的（即Fc 表达蛋白必须扩散到内部毛孔并穿过内部毛孔才能到达大多数蛋白质 A），而高压在柱子上下降，膜吸收器中的大量传输由散装对流驱动，从而避免了扩散限制8，9，11，12。此外，膜增压器的压力下降较低，因此与珠子包装柱8，9，11，12相比，进液流速更快。因此，对于实验室规模隔离，膜色谱学预计将减少几个小时的隔离时间，并增加产品捕获量相比，列色谱。此外，还提出了膜吸附器中IgG吸附的数学模型8，9，11，12，从而使最终用户能够预测实验室的性能。
基础科学和工程实验室的另一个瓶颈是Fc表达蛋白的特征。然而，选择适当的方法来完成定性检测，如西方的污点，可以大大减少花费在产品测试上的时间。例如，在不连续的缓冲系统中进行半干旱转移可以在几分钟内完成蛋白质从 SDS-PAGE 凝胶到聚乙烯二氟化物 （PVDF） 膜的电泳传输，而不是在连续缓冲系统13中 1-2 小时的罐（湿）转移。
这里描述了一种快速、廉价和有效的协议，以分离和描述表达人类IgG的Fc片段的奇妙融合蛋白。大多数设备在标准基础生物医学科学、生物学、化学和（生物）化学工程实验室中都随时可用，所有试剂均市售。虽然具有代表性的结果来自粘液加洛汀-1/人类Fc幻想融合蛋白（Gal-1hFc）的分离和特征，但流线型协议可以应用于其他具有Fc片段的分子的分离，如抗体、Fc片段本身或其他Fc融合蛋白。与标准方法相比，我们的改进显著缩短了处理时间（只有 4 小时，但通常为 9 小时，而工作时间为 20 小时以上），同时实现了类似的或改进的产品恢复。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="822">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Protein A membrane adsorber (Sartobind Protein A 2 ml)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Sartorius-Stedim</td>
			<td style="width:147px;">93PRAP06HB-12--A</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Amicon Ultra centrifugal filter, 10 kDa, 4 ml</td>
			<td style="width:191px;">Millipore</td>
			<td>UFC801008</td>
			<td>Use 15 ml volume if needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sterile vacuum filter unit, 0.22 &#181;m, 500 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">10 ml Syringes with Luer Lock tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">30 ml Syringes with&#160; Luer Lock tips</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tygon lab tubing (1/16 in x 1/8 in x 50 ft)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>WU-95903-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices (10K MWCO)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>69576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Snap i.d. antibody collection tray</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDABTR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Snap i.d. single well blot holder</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDBH01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Elution buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tris, ultra pure</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>819623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">DPBS</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:313px;">DPBS with Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Human Fc</td>
			<td>Bethyl Research Laboratories</td>
			<td>&#160;P80-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Anti-human Fc-APC</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>109136170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Anti-human Fc-AP</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-5018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Alkaline phosphatase substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">S3841</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:313px;">Flow cytometry tubes (5 ml polystyrene or polypropylene)</td>
			<td>BD</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:313px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-2226</td>
			<td style="width:173px;">A peristaltic pump is also acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Protein gel electrophoresis system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>552BR094876</td>
			<td style="width:173px;">Any gel electrophoresis system is acceptable, but mini gel systems run fastest</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Semidry blotter&#160;</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">690BR006163</td>
			<td style="width:173px;">Any transfer system is acceptable, but discontinuos transfer systems perform electrophoretic transfer fastest</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:313px;">SNAP i.d. vacuum-assisted protein detection system</td>
			<td style="width:191px;">EMD Millipore</td>
			<td>WBAVDBASE</td>
			<td style="width:173px;">An upgraded model has replaced this specific instrument, but either should work just as well</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of chimeric human fc-expressing proteins using protein a membrane adsorbers and a streamlined workflow

实验室规模到工业规模净化生物分子从细胞培养超纳特和溶解细胞解决方案可以完成使用亲和力色谱。虽然使用多孔蛋白A的生长珠包装在列中的亲和力色谱可以说是实验室规模隔离抗体和重组蛋白表达IgG片段的最常见方法，但它可能是一个耗时且昂贵的过程。时间和财政拮据在小型基础科学实验室尤其令人生畏，这些实验室必须从稀释溶液中回收数百微克至毫克的蛋白质，但缺乏获得高压液体输送系统和/或具有生物分离专业知识的人员。此外，产品量化和定性也可能在多个工作日过长加工时间，并膨胀费用（消耗品、工资 等）。因此，对于实验室规模隔离和抗体和其他具有 Fc 片段的蛋白质的特征，需要快速、廉价但有效的协议。为此，我们设计了一个协议，由经验有限的技术人员在不到9小时（大约一个工作日）和最快4小时，而不是传统的方法，需要20多工作小时完成。大多数所需的设备在标准生物医学科学、生物化学和（生物）化学工程实验室中随时可用，所有试剂均市售。为了证明这一协议，提出了具有代表性的结果，其中用一种蛋白质A膜增聚剂分离出从细胞培养超母体中融合到人类Fc（Gal-1hFc）的奇美穆林甘胶-1。纯化Gal-1hFc采用西方快速印迹分析程序进行量化，并采用流动细胞学进行特征分析。流线型工作流可用于其他 Fc 表达蛋白（如抗体）和/或更改，以纳入替代定量和定性方法。

简化的Fc表达蛋白分离和特征协议通常用于处理从稀释细胞培养超纳特人融合到人类Fc（Gal-1hFc）的奇美粘膜粘膜加洛汀-1。 图 2 中的流程图说明了协议中每个步骤的工作流程和时间。对于典型的 300 毫升超纳特批次，执行弹性分数的可选流细胞学测试时，总处理时间约为 9 小时。如果省略了所有流细胞分析，由于缺少流量细胞仪或单独的实验室偏好，总处理时间可以短至 4 小时。一般...

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Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

与传统的亲和色谱学相比，使用蛋白质A agarose珠状柱，蛋白质A膜吸收剂可以显著加快抗体和其他Fc片段表达蛋白的实验室规模隔离。适当的分析和量化方法可以进一步加快蛋白质加工，使隔离/定性可以在一个工作日内完成，而不是超过20个工作小时。

使用蛋白质膜吸收器和流线型工作流的奇美人 Fc 表达蛋白质的隔离和特征

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

isolation-characterization-chimeric-human-fc-expressing-proteins

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JoVE Journal

Bioengineering

7.0K 次观看.  Ohio University. 与传统的亲和色谱学相比，使用蛋白质A agarose珠状柱，蛋白质A膜吸收剂可以显著加快抗体和其他Fc片段表达蛋白的实验室规模隔离。适当的分析和量化方法可以进一步加快蛋白质加工，使隔离/定性可以在一个工作日内完成，而不是超过20个工作小时。