This study was supported by the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Project grant 1022839. AJH is an Australian Research Council (ARC) FT3 Future Fellow (FT100100835). The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health acknowledges support from the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Grant.

注：对动物的所有实验程序批准了神经科学和心理健康动物伦理委员会的弗洛里学院，并符合澳大利亚国家卫生和医学研究理事会公布的做法，动物科学目的的维护和使用的代码（ 第 7版， 2004年）。 1.环境手法<ol><li>性别配对<ol><li>使用性成熟（&gt; 8周龄），年龄匹配的雄性和雌性小鼠。 注意：我们通常使用C57BL / 6小鼠，但不得不使用Swiss小鼠在这个协议中相同的结果。我们通常使用每组8只雄性和n = 8的女性对每个实验，分成n = 2男男性对（N = 4男），N = 2女女对（N = 4女），和n = 4男女对（N = 4的男性和n = 4女）。 </li><li>抵达后进入动物圈养设施，集团内部的小鼠性别&gt; 3天适应环境。在这里，和通过量豪特性别配对，让外来的环境刺激（ 如环境温度，光照：黑暗循环，食物，水，处理和清洗）不变或平均分配给所有小鼠。 </li><li>随机每只小鼠分配给男性，男性对，女性对女性或男性，女性对。放置各对到干净笼子中隔离（2只小鼠/笼）与随意获得食物和水，并简单地连续地安置他们以这种方式为7天。 注：常规牧在此期间确定的，但一定要平均分配给所有小鼠。注意避免男女同窝的配对。 </li></ol></li><li>环境富集<ol><li>使用性成熟（&gt; 8周龄），年龄匹配的雄性或雌性小鼠。 注意：我们通常使用N = 18只小鼠的每个实验中，分成n = 6 /治疗组。 </li><li>抵达后进入动物圈养设施让他们组安置在同一封装标准（SH）（ 例如： </em&gt;见下文）的条件下，在这个阶段&gt; 3天适应环境。在这里和在整个实验中，保持外来环境刺激（ 如环境温度，灯：暗循环，食物，水，处理和清洗）恒定或平均分配给所有小鼠。 </li><li>开始环境富集，随机分配每只小鼠3组之一：SH;运行轮（RW）或环境富集的（EE），并放置各组小鼠的汇集成一个相同的干净笼子具有随意获取食物和水。 注：在这里，大老鼠拿着笼子所有群体，测量27厘米宽42厘米长，16厘米深的被使用。 <ol><li>此外，提供以下环境条件下各组：地板上的SH只包括垃圾（纸张颗粒或木屑）; RW包括SH加2转轮; EE包括RW加玩具（绳索，梯子，隧道，和对象，如空纸巾卷和张纸巾），用以前PLORE，玩，爬，隐藏和鸟巢。 </li><li>以这种方式连续地安置他们14天。 注：常规牧在此期间确定的，但一定要平均分配给所有小鼠。 </li></ol></li><li>受EE小鼠额外“超浓缩”（SE）通过将它们一起放入含新玩具1小时/天（同一时间的每一天），5天/周更大的笼子里。 注：在这里，宽46厘米，69厘米长，40厘米深的塑料桶被使用。 <ol><li>通过提供一组不同的玩具每个会话保持新鲜感。干净的玩具要被重新提交给小鼠用肥皂水和80％的乙醇以去除气味。 </li><li>在每次SE会话，返回的小鼠其EE笼子。手柄SH和RW老鼠一样SE小鼠（除SE本身）在此期间（ 例如删除和以及它的笼子里返回每个SH和RW鼠标）。 </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li>准备<ol><li>使用无菌渗透泵和脑输注套件，其是市售的。植入前一天，使用无菌技术，首要的植入物通过填充每个泵，连接管和套管与无菌的药物或载体溶液（如在与泵提供的说明书所述）。将其连接在一起，并培育在无菌盐水中过夜，在37℃。分别孵育毒品和车辆充注式假以避免交叉污染。 </li></ol></li><li>手术治疗。 注：根据实验者的国家，特种动物实验许可或津贴必须追求这种类型的手术和术后实验。 <ol><li>消毒所有的手术设备，聘请整个无菌技术。麻醉鼠标（ 例如使用在空气中1-2％异氟烷），并将其放置在一个立方米otaxic井架。检查麻醉深度在整个过程和管理进一步麻醉剂作为必要（例如缺席肢撤回到有毒爪夹紧指示充足麻醉）。确保眼睛免受干燥通过润滑剂眼膏，和鼠标的体温保持正常的整个过程。 </li><li>通过从眼睛2之间整理开始厘米后路头骨的背面边缘的皮肤作正中切口。钝解剖皮肤远离底层筋膜按住鼠标的背面以创建皮下“口袋”足够大，以舒适地配合在泵和连接管，一旦插管植入（连接管不应该被完成时弯曲）。刮清除筋膜来自头骨的背侧。 </li><li>使用约1.5毫米直径的牙科毛刺，深入到颅骨在适当的立体坐标üNTIL骨的一个薄的，柔性层保留。撕下使用细镊子这层（这避免损坏底层硬脑膜及脑与牙科毛刺）。确保颅骨被清洁的任何血液和骨头碎片，而没有进一步的出血。 </li><li>与由一个套管夹持器保持的插管，放置在泵和连接管进入皮下“口袋”覆盖在小鼠的背部。接着，在适当的立体坐标和大脑的表面上定位插管的尖端。小心地将导管进入大脑，但停止大约为1毫米的短所需的深度。 注：其余深度将下列申请牙科丙烯酸的第一层的协商。 </li><li>确保再次头骨的表面清洁，干燥，然后准备一个小体积的牙科丙烯酸及用牙签来平滑它在头骨的整个暴露面积，包括入毛刺孔通过围绕日头骨Ë套管。前的丙烯酸类变硬，降低套管末端剩余深度到目标。 </li><li>准备另一个小体积的牙科丙烯酸和在第一层这一点，以及在该插管的白色塑料支撑，固定到位插管。重复与丙烯酸的附加层是必要的。 </li><li>一旦亚克力硬化，小心地取出导管架，切断用手术刀与丁烷火焰加热的白色塑料套管可拆卸标签。最后，缝合封闭在整个植入皮肤。 </li></ol></li><li>动物手术后的治疗<ol><li>应用防腐剂软膏在皮肤上边距，和管理抗炎到鼠标（ 例如美洛昔康，3毫克/千克SC）。从框架中取出鼠标，将其放置在加热灯下，观察，直到它恢复意识。不要返回鼠标已经动过手术，以其他动物的公司，直到完全康复。 注：EXPerimental操作如性别配对和环境富集可以启动或次日手术最早恢复。 </li><li>监测他们的体重，日常一般行为和外观。治疗感染周围的手术切口外用抗菌软膏迹象（ 如肿胀，充血，脓）。治疗任何疾病的迹象，疼痛，压力或不适（ 如丢失&gt; 10％的体重，社交退缩，缺乏疏导，“起毛”，运动功能障碍，癫痫发作）全身镇痛药和/或抗生素是必要的。 </li><li>安乐死的小鼠，如果&gt; 15％的重量损失或疾病，疼痛，压力或不适的症状是1周补救处理中不可恢复的。 </li></ol></li></ol> 3.脑组织制备，免疫组化处理和体视<ol><li>灌注<ol><li>紧接着环境/药物操作，准备的大脑进行研究。 <br/&gt;注意：在这里报导的实验致密TH +神经元的数目进行测定，在每一个不同的治疗组进行比较。 </li><li>一是管理的麻醉剂过量杀死小鼠（ 如 100毫克/公斤的IP戊巴比妥钠）。一旦麻醉，但前心脏停止跳动，躺在它的后面鼠标和领带或牵制前肢。 </li><li>使用手术刀切开皮肤覆盖在胸部，然后通过正下方的肋笼肌肉切开进入腹腔。放置夹在胸腔的剑突和肝脏暴露隔膜抬起胸腔起来了。 </li><li>切穿隔膜，并通过横向两侧使用大剪刀，直到胸腔可以折回在头上以暴露肺和心脏的肋骨。使用细剪刀作一小切口在右心房作为退出点为血液和灌注溶液，然后通过左ventri的基部切CLE并放置套管向上通过左心室，左心房，并进入主动脉。 </li><li>夹紧套管就位然后泵温热（37℃）肝素和0.1M磷酸盐缓冲通过脉管，直至溶液离开右心房生理盐水（PBS）是完全自由的血液。接着，通过脉管泵冷（4℃）固定液（在PBS中，如4％多聚甲醛），直到整个鼠标被固定好。取出大脑并放入PBS中，用30％的蔗糖为2-3天，直到大脑汇。 注：其它类型的组织制剂可能取决于在相应的实验室的专门知识被应用。 </li></ol></li><li>自由浮动的冷冻切片的制备<ol><li>通过感兴趣脑区切连续切片和在PBS中收集这些。 注：我们下调用低温恒温器40微米厚的部分。其它类型的组织切片可能根据在correspondi的专业知识应用吴的实验室。 </li></ol></li><li>免疫组化<ol><li>感兴趣的蛋白质进行免疫组化的标准。孵育在PBS中的5％正常山羊血清和0.3％的Triton X-100的部分在室温下30分钟，然后用免疫反应的多克隆兔抗TH（1：400），在4℃下48小时，然后生物素化的多克隆山羊抗 - 兔（1：1000），在室温下搅拌2小时。 </li><li>接着，孵育在抗生物素蛋白 - 过氧化物酶（1：500），在室温下搅拌1小时，然后在钴和镍的强化二氨基联苯胺（0.5毫克/毫升）在室温下搅拌18-20分钟;对二氨基联苯胺孵育的最后3-5分钟添加过氧化氢（0.01％）以催化发色沉淀。前，后，和上述各步骤之间的冲洗切片3次，10分钟的每个在PBS。 </li><li>安装部分的糊化显微镜载玻片，风干他们，那么尼氏染色（中性红），脱水酒精，清除（X-3B）和盖玻片。 </li></ol></li><lI&gt;体视<ol><li>估计TH +和TH-黑质致密（和VTA和LC）的神经元的使用无偏体视学方法的总数。确保stereologist是盲目的接受治疗。排除神经胶质细胞体直径&lt;5μm的基础上，并只计算那些细胞具有可见细胞核。 </li><li>通过TH +细胞，并根据Paxinos和Watson 7的脑图谱解剖标志/边界的空间位置识别黑质致密部（VTA和LC和）。计数的计数帧内TH +细胞（55×55微米= 3025微米2）以规则的预定的时间间隔（X = 140微米，Y = 140微米为黑质致密; X = 100微米，Y = 100微米为VTA和LC）贯穿在每一个第四部分中的每个细胞核。 </li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+enrichment+exposure+on+synaptic+transmission+and+plasticity+in+the+hippocampus.">Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus.</a> Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).</li><li>Sztainberg, Y., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmental+enrichment+model+for+mice.">An environmental enrichment model for mice.</a> Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).</li><li>Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+brain+plasticity:+towards+an+endogenous+pharmacotherapy.">Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy.</a> Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

操作环境 这些环境的操纵（性别配对和丰富环境）的设计背后的动机是为了确定是否对环境，和/或行为的环境提示时，与变化的中脑多巴胺神经元的数量有关。因此，重点是提供环境和刺激行为有可能从事脑DA信号。这些措施包括配对异性和丰富环境，包括访问运行车轮，绳索，梯子，隧道，和对象的探索，玩耍，攀爬，隐藏和鸟巢。这两种环境都应该促进奖励激励?...

DArgic信号通过在中脑腹侧被盖区（VTA）和黑质致密部（SNC）的神经元被认为是为奖励激励的认知，情感和运动行为的重要。但是，过多或过少的中脑多巴胺信令引起各种神经病症的许多禁用症状（ 例如 ，帕金森氏病，注意力缺陷多动障碍，精神分裂症，和药物成瘾）。药物提高或降低的DA信令缓解这些症状，但它们也产生副作用可归因于失调信令和脱靶效应。药物功效也随时间下降，由于脑的代偿反应。因此面临的挑战是在一个更有针对性和生理方式恢复正常脑多巴胺信令，以及一个偏爱的方法是通过增加或减少中脑多巴胺神经元的数目。 证据已经积累了SEVERAL几十年来，参与代谢和贩运DA等儿茶酚胺类物质在成熟的成体细胞的基因和蛋白质的表达是可以修改的（1回顾）。在中脑，酪氨酸羟化酶免疫阳性的数量（TH + DA中合成的限速酶）的神经元减小然后增大以下的神经毒素给药2,3，而TH免疫阴性（TH-）的神经元的数量示出了相反的模式（ 即增加然后下降3）。这是与损失一致，那么获得了“DA型”的一些细胞。 TH +和TH-致密的神经元的数量也已表明下列即改变这些细胞4,5的电活动的各种处理中相等，但相反的方向发生变化。例如，输注小电导的钙活化的钾（SK）通道拮抗剂蜂毒明肽进入脑2周（以相同的量）减少TH +和增加的数目的NUTH-的黑质神经元MBER 4,5。与此相反，注入对SK通道激动剂1- EBIO的增加TH +的数量和减小（以相同的量）TH-致密的神经元4,5的数量。类似的变化被视为承接各种针对黑质神经元的活动，包括一些有针对性的传入输入4个处理。致密DArgic神经元的数目的由神经元活性和传入输入此表观调节引起该环境或行为可以影响黑质致密的神经元的数量的可能性。暴露在不同的环境中确实成年小鼠具有更多或更少的中脑（SNC和VTA）TH +神经元，并且至少其中的一些环境引起的变化由突触输入的中脑6并发封锁被废除。这种沟通的目的是：（1）提供有关如何实现我们的环保操作和药物输注进一步详情; （2）提供进一步的数据支持我们的论点，即电子nvironment调节中脑多巴胺神经元的数目， 经由传入输入。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1300">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:636px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:636px;">Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia</td>
			<td style="width:119px;">AHN3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET Osmotic pump 1002</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0004317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET Brain infusion kit 1</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0004760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET cannula holder 1</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0008860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent)</td>
			<td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Vertex Self Curing (dental acrylic powder)</td>
			<td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">METACAM (Meloxicam)</td>
			<td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia</td>
			<td style="width:119px;">L10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Sodium Pentobarbitone</td>
			<td>Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia</td>
			<td style="width:119px;">571177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Normal goat serum</td>
			<td>chemicon-temecula, CA</td>
			<td style="width:119px;">S26-Litre</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Triton X-100</td>
			<td>Merck Millipore Headquarters&#160;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td>
			<td style="width:119px;">1.08603.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase</td>
			<td>Merck Millipore Headquarters&#160;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td>
			<td style="width:119px;">AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit</td>
			<td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060</td>
			<td style="width:119px;">EO432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avidin peroxidase</td>
			<td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td>
			<td style="width:119px;">A3151-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamino-benzidine</td>
			<td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td>
			<td style="width:119px;">D-5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo Investigator</td>
			<td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

environmental modulations of the number of midbrain dopamine neurons in adult mice

在大脑或“大脑可塑性”持久的变化背后以下疾病或损伤适应行为和大脑修复。此外，我们的环境之间的相互作用可以引起大脑的可塑性。越来越多的研究，试图找出其中的环境刺激大脑的可塑性有利于治疗大脑和行为障碍。两个环境的操作中，描述了增加或减少的酪氨酸羟化酶免疫阳性的数量（TH +中多巴胺（DA）的合成中的限速酶）的神经元，在成年小鼠中脑。第一配对包括雄性和雌性小鼠持续1周，其中约12％的男性增加中脑TH +神经元一起，但大约12％的女性降低中脑TH +神经元。所述第二壳体包括小鼠连续2周在含有运行车轮，玩具，绳索，排料等，“富集环境&#39;（EE），我通过在雄性约14％ncreases脑TH +神经元。此外，协议中描述的同时注入药物直接进入脑在这些环境的操作，以帮助识别潜在的环境引起的大脑可塑性的机制。例如，EE-诱导更多的脑TH +神经元的突触输入的同时封锁到脑神经元废止。总之，这些数据表明，有关环境的信息是通过突触输入中继到中脑的神经元，以打开或关闭的“DA”基因的表达。因此，适当的环境刺激，或药物的基本机制的靶向，可能是用于治疗与中脑多巴胺失衡有关的脑和行为障碍有用（ 例如，帕金森氏病，注意力缺陷多动障碍，精神分裂症，和药物成瘾）。

经受这些环境操纵成年小鼠已经改变脑的号码（SNC和VTA），但不LC，TH +神经元，和EE加要么印防己毒素或荷包牡丹碱并发脑灌注（GABA A受体拮抗剂）废除EE-诱导更致密TH +神经元。这些数据此前公布的6人。本资料汇编中如以前的研究的一部分进行重复实验，但还没有在其他地方发表。 具体来说，已配对的成年雌性小鼠成年雄性小鼠有更多的TH +黑质致密部和腹?...

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Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

中脑多巴胺神经元的数目在成年小鼠环境的调变

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

environmental-modulations-number-midbrain-dopamine-neurons-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K 次观看.  The University of Melbourne. This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.