This study was supported by the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Project grant 1022839. AJH is an Australian Research Council (ARC) FT3 Future Fellow (FT100100835). The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health acknowledges support from the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Grant.

NOTA: Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Instituto Florey del Comité de Ética de Salud Animal Neurociencia y Salud Mental y se ajustan a Nacional de Salud de Australia y el Consejo de Investigación Médica publica código de prácticas para el cuidado y uso de animales para fines científicos (7ª edición, 2004). 1. Las manipulaciones ambientales <ol><li> El emparejamiento de Género <ol><li> Use la madurez sexual (&gt; 8 semanas de edad), hombres de la misma edad y ratones hembras. NOTA: normalmente utilizamos ratones C57BL / 6, pero hemos tenido los mismos resultados utilizando ratones Swiss en este protocolo. Utilizamos típicamente n = 8 hombres y n = 8 hembras para cada experimento, dividida en n = 2 pares entre varones (n = 4 machos), n = 2 pares hembra-hembra (n = 4 mujeres), y n = 4 parejas hombre-mujer (n = 4 machos y 4 hembras = n). </li><li> A su llegada a las instalaciones de confinamiento de los animales, el grupo de la casa los ratones por género para&gt; 3 días para aclimatarse. Aquí y througHout el emparejamiento de género, a mantener los estímulos ambientales extraños (por ejemplo, la temperatura ambiente, la luz: oscuridad ciclo, alimentos, agua, manejo y limpieza) constante o distribuir por igual a todos los ratones. </li><li> Aleatoriamente asignar cada ratón a un par macho-macho, un par hembra-hembra, o un par masculino-femenino. Coloque cada par en una jaula limpia en el aislamiento (2 ratones / jaula) con acceso ad libitum a comida y agua, y simplemente alojarlos en esta manera de forma continua durante 7 días. NOTA: la cría de animales de rutina está bien durante este periodo, pero se debe distribuir por igual a todos los ratones. Tenga cuidado de evitar el emparejamiento de camada masculinos y femeninos. </li></ol></li><li> Enriquecimiento Ambiental <ol><li> Utilice (&gt; 8 semanas de edad), hombres o mujeres ratones de la misma edad sexualmente maduros. NOTA: Por lo general utilizamos n = 18 ratones para cada experimento, divididos en grupo n = 6 / tratamiento. </li><li> A su llegada a las instalaciones de confinamiento de los animales ellos mantener encuentra alojada en grupo en la norma idéntica (SH) (por ejemplo, </em&gt; Ver más abajo) las condiciones en esta etapa durante&gt; 3 días para aclimatarse. Aquí y en todo el experimento, mantener los estímulos ambientales extraños (por ejemplo, la temperatura ambiente, la luz: oscuridad ciclo, alimentos, agua, manejo y limpieza) constante o distribuir por igual a todos los ratones. </li><li> Para comenzar con el enriquecimiento ambiental, asignar aleatoriamente cada ratón a uno de los 3 grupos: SH; rueda de correr (RW), o el medio ambiente enriquecido (EE) y coloque cada grupo de ratones juntos en una jaula limpia idéntica con acceso ad libitum a comida y agua. NOTA: Aquí, jaulas más grandes de ratas celebración para todos los grupos, que miden 27 cm de ancho, 42 cm de largo y 16 cm de profundidad se utilizaron. <ol><li> Además, proporcionará las siguientes condiciones ambientales para cada grupo: SH comprende sólo la basura (pellets de papel o serrín) en el suelo; RW comprende SH más 2 ruedas de funcionamiento; EE comprende RW además de juguetes (cuerdas, escaleras, túneles, y objetos como rollos y trozos de papel de seda de toallas de papel vacío) con el que a explore, jugar, trepar, esconderse, y el nido. </li><li> Casa ellos de esta manera de forma continua durante 14 días. NOTA: la cría de animales de rutina está bien durante este periodo, pero se debe distribuir por igual a todos los ratones. </li></ol></li><li> Ratones EE Sujeto a &#39;super-enriquecimiento&#39; adicional (SE) colocándolos juntos en una jaula más grande que contiene nuevos juguetes para 1 hora / día (la misma hora cada día), 5 días / semana. NOTA: Aquí, se utilizó una tina de plástico 46 cm de ancho, 69 cm de largo y 40 cm de profundidad. <ol><li> Mantener la novedad al presentar un conjunto diferente de juguetes cada sesión. Limpie los juguetes que se van a volver a ser presentados a los ratones con agua jabonosa y etanol al 80% para eliminar los olores. </li><li> Después de cada sesión de SE, devolver los ratones a su jaula EE. SH Mango y ratones RW igual que los ratones SE (a excepción de SE en sí) a lo largo de este período (por ejemplo, eliminar y volver cada SH y el ratón RW desde y hacia su jaula). </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> Preparación <ol><li> Utilice bombas osmóticas estériles y kits de infusión de cerebro, que están disponibles comercialmente. El día antes de la implantación, utilizando una técnica aséptica, primos los implantes llenando cada bomba, tubo y la cánula de conectar con una solución de fármaco o vehículo estéril (como se describe en las instrucciones suministradas con las bombas). Conectarlos entre sí y se incuba en solución salina estéril durante la noche a 37 ° C. Incubar implantes drogas y vehículos llenos por separado para evitar la contaminación cruzada. </li></ol></li><li> Cirugía. NOTA: En función del país del experimentador, se requieren permisos o autorizaciones de experimentación de animales especiales para perseguir ese tipo de cirugía y experimentos postoperatorias. <ol><li> Esterilizar todo el equipo quirúrgico y emplear una técnica aséptica en todo. Anestesiar el ratón (por ejemplo, utilizando 2.1% isofluorano en el aire) y colocarlo en un estéreocastillete otaxic. Compruebe la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento y administrar más anestésico si es necesario (por ejemplo, ausencia de retirada extremidad para pizca pata nociva es indicativo de una anestesia adecuada). Asegurar los ojos están protegidos de la desecación por pomada ocular lubricante, y que la temperatura corporal del ratón sigue siendo normal durante todo el procedimiento. </li><li> Hacer una incisión en la línea media a través de la piel a partir de entre los ojos y acabado de 2 cm por detrás del borde posterior del cráneo. Blunt diseccionar la piel lejos de la fascia subyacente en la parte posterior del ratón para crear un subcutánea &#39;bolsillo&#39; lo suficientemente grande como para caber cómodamente la bomba y el tubo de conexión una vez se implanta la cánula (el tubo de conexión no debe estar doblada sobre la terminación). Raspe borrar la fascia de más de la cara dorsal del cráneo. </li><li> El uso de una fresa dental de aproximadamente 1,5 mm de diámetro, profundizar en el cráneo en el estereotáxica apropiado coordina uasta una capa delgada, flexible de restos óseos. Peel esta capa de distancia utilizando unas pinzas finas (esto evita dañar la duramadre subyacente y el cerebro con la fresa dental). Asegúrese de que el cráneo se limpió de cualquier fragmento de sangre y hueso, y no que hay más sangrando. </li><li> Con la cánula en manos de un portador de cánula, coloque la bomba y el tubo de conexión en el &#39;bolsillo&#39; subcutánea que recubre la parte posterior del ratón. A continuación, la posición de la punta de la cánula en las coordenadas estereotáxicas apropiadas y en la superficie del cerebro. Baje con cuidado la cánula en el cerebro, pero dejar de aproximadamente 1 mm de cortos de la profundidad requerida. NOTA: La profundidad restante se negoció después de la aplicación de la primera capa de acrílico dental. </li><li> Asegúrese de nuevo la superficie del cráneo esté limpia y seca, y luego preparar un pequeño volumen de acrílico dental y usar un palillo de dientes para alisarlo sobre toda el área expuesta de cráneo, incluidos en la rebaba-agujero a través del cráneo alrededor ªe cánula. Antes de que el acrílico se endurece, baje la cánula de punta la profundidad restante en el objetivo. </li><li> Se prepara otro pequeño volumen de acrílico dental y la capa de esto sobre el primero, así como sobre el soporte plástico blanco para la cánula, para fijar la cánula en su lugar. Repita con capas adicionales de acrílico como necesario. </li><li> Una vez que el acrílico ha endurecido, retirar con cuidado el soporte de cánula y cortar el plástico pestaña cánula extraíble blanco con una hoja de bisturí calentado con una llama de butano. Por último, suturar la piel cerrado sobre todo el implante. </li></ol></li><li> Tratamiento post-quirúrgico de los Animales <ol><li> Aplicar ungüento antiséptico a los márgenes de la piel, y administrar un anti-inflamatorio para el ratón (por ejemplo, Meloxicam, 3 mg / kg sc). Retire el ratón desde el marco, colocarla bajo una lámpara de calor, y observar hasta que se recupera la conciencia. No devuelva un ratón que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. NOTA: Expmanipulaciones erimental como el emparejamiento entre los géneros y el enriquecimiento medio ambiente se pueden iniciar o reanudar el día después de la cirugía a la mayor brevedad. </li><li> Controlar su peso corporal, el comportamiento y el aspecto general diaria. Tratar signos de infección (por ejemplo, hinchazón, enrojecimiento, pus) alrededor de las incisiones quirúrgicas con ungüento antiséptico tópico. Tratar cualquier signos de enfermedad, el dolor, el estrés o malestar (por ejemplo, pérdida de&gt; 10% del peso corporal, el aislamiento social, la falta de preparación, &quot;esponjar&quot;, disfunción del movimiento, convulsiones) con analgésicos y / o antibióticos sistémicos como necesario. </li><li> La eutanasia a los ratones si la pérdida de peso&gt; 15% o síntomas de la enfermedad, el dolor, el estrés o malestar no son recuperables dentro de 1 semana de tratamiento curativo. </li></ol></li></ol> 3. Tejido Cerebral Preparación, producción inmunohistoquímica, y Estereología <ol><li> Perfusión <ol><li> Inmediatamente después de manipulaciones / drogas ambientales, preparar el cerebro para el estudio. <br/&gt; NOTA: En los experimentos publicados aquí se mide y se compara en cada uno de los diferentes grupos de tratamiento el número de TH + SNc neuronas. </li><li> Primera administrar una sobredosis de anestesia para matar los ratones (por ejemplo, 100 mg / kg ip de sodio pentobarbital). Una vez anestesiado, pero antes de que el corazón deja de latir, poner el ratón sobre su espalda y corbata o precisar ambas extremidades anteriores. </li><li> Usando un escalpelo cortó la piel que recubre el tórax entonces incise a través del músculo justo debajo de la caja torácica en la cavidad abdominal. Coloque una abrazadera en el proceso xifoides de la caja torácica y levantar la caja torácica hacia arriba y lejos del hígado exponer el diafragma. </li><li> Corte a través del diafragma y por medio de las costillas lateralmente en ambos lados con grandes tijeras hasta que la caja torácica se puede plegar hacia atrás la cabeza para exponer los pulmones y el corazón. Con unas tijeras finas hacen una pequeña incisión en la aurícula derecha como un punto de salida para la sangre y soluciones perfundidos, luego se corta a través de la base de la Ventri izquierdaCLE y colocar una cánula a través del ventrículo izquierdo, la aurícula izquierda, y en la aorta. </li><li> Sujetar la cánula en su lugar a continuación, la bomba caliente (37 ° C) heparinización y 0,1 M tampón fosfato salino fisiológico (PBS) a través de la vasculatura hasta que la solución que sale de la aurícula derecha es totalmente libre de sangre. A continuación, la bomba de frío (4 ° C) solución de fijación (tales como 4% de paraformaldehído en PBS) a través de la vasculatura hasta que todo el ratón está bien fijado. Retire el cerebro y el lugar en PBS con 30% de sacarosa durante 2-3 días hasta que los sumideros cerebrales. NOTA: Otros tipos de preparación de tejidos podrían aplicarse en función de la experiencia en el laboratorio correspondiente. </li></ol></li><li> Preparación de criosecciones de flotación libre <ol><li> Cortar secciones de serie a través de las regiones cerebrales de interés y recoger estos en PBS. NOTA: Cortamos 40 micras de espesor secciones usando un criostato. Otros tipos de seccionar los tejidos podrían aplicarse en función de la experiencia en el corresponding de laboratorio. </li></ol></li><li> La inmunohistoquímica <ol><li> Realizar inmunohistoquímica estándar para proteínas de interés. Incubar las secciones en 5% de suero normal de cabra y 0.3% de Triton X-100 en PBS a temperatura ambiente durante 30 min, a continuación, inmunorreaccionan con policlonal de conejo anti-TH (1: 400) a 4 ° C durante 48 horas, a continuación, policlonal de cabra anti biotinilado -rabbit (1: 1000) a temperatura ambiente durante 2 hr. </li><li> A continuación, se incuban en avidina-peroxidasa (1: 500) a temperatura ambiente durante 1 hora, a continuación, en cobalto y diamino-bencidina níquel-intensificado (0,5 mg / ml) a temperatura ambiente durante 18-20 min; para el último 3-5 min de la incubación diamino-bencidina añadir peróxido de hidrógeno (0,01%) para catalizar la precipitación cromógeno. Lavar las secciones tres veces durante 10 minutos cada uno en PBS antes de, después de, y entre cada uno de los pasos anteriores. </li><li> Montar las secciones en portaobjetos gelatinizados, aire los seque, luego mancha Nissl (rojo neutro), deshidratar en alcohol, claro (X-3B), y tapar. </li></ol></li><li&gt; Estereología <ol><li> Estimar el número total de neuronas TH + y TH SNc (LC y VTA) y usando métodos estereológicos imparciales. Asegúrese de que el stereologist es ciega al tratamiento recibido. Excluir glia sobre la base de diámetro soma &lt;5 micras y contar sólo aquellas células con un núcleo visible. </li><li> Identificar la SNC (y VTA y LC) por las localizaciones espaciales de células TH + y referencias anatómicas / límites de acuerdo con el atlas del cerebro de Paxinos y Watson 7. Contar + células TH dentro de un marco de cuenta (55 x 55 micras = 3,025 micras 2) a intervalos predeterminados regulares (x = 140 m, y = 140 m para SNc; x = 100 m, y = 100 m para VTA y LC) a través de cada núcleo en cada cuarta sección. </li></ol></li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions+and+construct+validity+in+preclinical+models+of+psychiatric+disorders.">Gene-environment interactions and construct validity in preclinical models of psychiatric disorders.</a> Progress in neuro-psychopharmacology &amp; biological psychiatry. 35, 1376-1382 (2011).</li><li>Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+of+preference+for+nesting+material+as+environmental+enrichment+for+laboratory+mice.">Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice.</a> Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).</li><li>Rampon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+enrichment+on+gene+expression+in+the+brain.">Effects of environmental enrichment on gene expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12880-12884 (2000).</li><li>Eckert, M. J., Abraham, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+environmental+enrichment+exposure+on+synaptic+transmission+and+plasticity+in+the+hippocampus.">Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus.</a> Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).</li><li>Sztainberg, Y., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmental+enrichment+model+for+mice.">An environmental enrichment model for mice.</a> Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).</li><li>Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+brain+plasticity:+towards+an+endogenous+pharmacotherapy.">Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy.</a> Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Manipulaciones ambientales La motivación detrás del diseño de estas manipulaciones ambientales (emparejamiento de género y de enriquecimiento ambiental) fue determinar si el medio ambiente y / o la conducta motivada por el medio ambiente, se asocia con cambios en el número de neuronas DA mesencéfalo. La atención se centró por tanto en proporcionar entornos y estimular comportamientos que son propensos a participar señalización DA mesencéfalo. Estos maridaje incluido con e...

DArgic de señalización por las neuronas en el área ventral tegmental (VTA) y substantia nigra pars compacta (SNc) del mesencéfalo se piensa que es importante para los comportamientos cognitivos, emotivos y de motor de recompensa-motivados. Sin embargo, la señalización DA mesencéfalo demasiado o demasiado poco causa muchos síntomas incapacitantes en una variedad de trastornos neurológicos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, déficit de atención e hiperactividad, esquizofrenia y drogadicción). Las drogas que aumentan o disminuyen DA señalización aliviar estos síntomas, sin embargo, también producen efectos secundarios atribuibles a la señalización desregulada y fuera de objetivo efectos. La eficacia del fármaco también disminuye con el tiempo debido a las respuestas compensatorias del cerebro. Por tanto, el reto es restaurar la señalización de DA del cerebro medio normal de manera más específica y fisiológica, y un enfoque preferido es aumentando o disminuyendo el número de neuronas DA del cerebro medio. La evidencia ha ido acumulando para sevdécadas va- que la expresión de genes y proteínas implicados en el metabolismo y DA trata y otras catecolaminas en células adultas madura es modificable (revisado en 1). En el mesencéfalo, el número de immunopositive tirosina hidroxilasa (TH +, la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de las neuronas DA) disminuye luego aumenta después de la administración de neurotoxina 2,3, mientras que el número de TH immunonegative (TH) neuronas muestra el patrón opuesto (es decir, aumenta luego disminuye 3). Esto es consistente con la pérdida de entonces ganancia de la &#39;DA fenotipo&#39; por algunas células. El número de neuronas TH + y TH SNc También se ha demostrado que cambiar en direcciones iguales pero opuestas después de diversos tratamientos que alteran la actividad eléctrica de estas células a 4,5. Por ejemplo, la infusión de la pequeña conductancia, potasio activado por calcio (SK) canal apamina antagonista en cerebro medio durante 2 semanas disminuye el número de TH + y aumenta (en la misma cantidad) la numbre de TH SNc neuronas 4,5. En contraste, la infusión de la SK agonista de canal de 1 EBIO aumenta el número de TH + y disminuye (en la misma cantidad) el número de neuronas TH SNc 4,5. Se observaron cambios similares después de una gran variedad de tratamientos dirigidos actividad neuronal SNc, incluyendo algunos que dirige impulsos aferentes 4. Esta aparente regulación del número de neuronas SNc DArgic por la actividad neuronal aferente de entrada y plantea la posibilidad de que el medio ambiente o el comportamiento pueden influir en el número de neuronas del SNC. De hecho ratones adultos expuestos a diferentes ambientes tienen más o menos cerebro medio (SNc y VTA) TH + neuronas, y al menos algunos de estos cambios inducidos por el medio ambiente se abolido por el bloqueo simultáneo de entrada sináptica en el cerebro medio 6. Los objetivos de esta comunicación son: (1) proporcionar más detalles sobre la forma de aplicar nuestras manipulaciones ambientales e infusiones de drogas; y (2) proporcionar más datos que apoyan nuestra afirmación de que el embiente regula el número de neuronas DA del cerebro medio, a través de los impulsos aferentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1300">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:636px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:636px;">Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia</td>
			<td style="width:119px;">AHN3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET Osmotic pump 1002</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0004317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET Brain infusion kit 1</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0004760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">ALZET cannula holder 1</td>
			<td style="width:636px;">DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td>
			<td>0008860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent)</td>
			<td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Vertex Self Curing (dental acrylic powder)</td>
			<td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">METACAM (Meloxicam)</td>
			<td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia</td>
			<td style="width:119px;">L10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Sodium Pentobarbitone</td>
			<td>Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia</td>
			<td style="width:119px;">571177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Normal goat serum</td>
			<td>chemicon-temecula, CA</td>
			<td style="width:119px;">S26-Litre</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Triton X-100</td>
			<td>Merck Millipore Headquarters&#160;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td>
			<td style="width:119px;">1.08603.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase</td>
			<td>Merck Millipore Headquarters&#160;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td>
			<td style="width:119px;">AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit</td>
			<td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060</td>
			<td style="width:119px;">EO432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Avidin peroxidase</td>
			<td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td>
			<td style="width:119px;">A3151-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamino-benzidine</td>
			<td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td>
			<td style="width:119px;">D-5637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo Investigator</td>
			<td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

environmental modulations of the number of midbrain dopamine neurons in adult mice

Cambios duraderos en el cerebro o la &quot;plasticidad cerebral&quot; subyacen a la conducta adaptativa y la reparación cerebral después de una enfermedad o lesión. Por otra parte, las interacciones con el medio ambiente pueden inducir plasticidad cerebral. Cada vez más, la investigación está tratando de identificar qué entornos estimular la plasticidad del cerebro beneficioso para el tratamiento de trastornos del cerebro y del comportamiento. Dos manipulaciones ambientales que se describen aumentar o disminuir el número de immunopositive tirosina hidroxilasa (TH +, la enzima limitante de la velocidad en la dopamina (DA) de síntesis) neuronas en el cerebro medio del ratón adulto. El primero comprende macho emparejamiento y ratones hembra juntos de forma continua durante 1 semana, lo que aumenta TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente 12% en los hombres, pero disminuye TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente un 12% en las mujeres. El segundo comprende los ratones de vivienda de forma continua durante 2 semanas en &#39;ambientes enriquecidos &quot;(EE) que contienen ruedas corriendo, juguetes, cuerdas, material de nidificación, etc., que increases TH + neuronas del cerebro medio en aproximadamente un 14% en los hombres. Además, un protocolo se describe para infundir simultáneamente fármacos directamente en el cerebro medio durante estas manipulaciones ambientales para ayudar a identificar los mecanismos subyacentes plasticidad cerebral inducida por el medio ambiente. Por ejemplo, EE-inducción de más TH + neuronas del cerebro medio es abolida por el bloqueo simultáneo de entrada sináptica en las neuronas del cerebro medio. En conjunto, estos datos indican que la información sobre el medio ambiente se transmite a través de la entrada sináptica de las neuronas del cerebro medio para activar o desactivar la expresión de los genes &#39;da&#39;. Por lo tanto, la estimulación ambiental apropiada, o fármaco que se dirige de los mecanismos subyacentes, podría ser útil para el tratamiento de trastornos cerebrales y conductuales asociados con desequilibrios en el cerebro medio DA (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson, el déficit de atención e hiperactividad, esquizofrenia y drogadicción).

Los ratones adultos sometidos a estas manipulaciones ambientales han alterado los números de cerebro medio (SNC y VTA), pero no LC, neuronas TH +, y EE más infusión cerebro medio concurrente de ambos picrotoxina o bicuculina (GABA antagonistas del receptor) suprime EE-inducción de más SNc TH + neuronas. Estos datos fueron publicados previamente en 6. Los datos actuales se compilaron en replicar experimentos realizados como parte de ese estudio previo, pero no se han publicado en otros lugares....

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Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Modulaciones Ambientales del Número de dopamina mesencéfalo neuronas en ratones adultos

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

environmental-modulations-number-midbrain-dopamine-neurons-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K vistas.  The University of Melbourne. This protocol describes two different environmental manipulations and a concurrent brain infusion protocol to study environmentally-induced brain changes underlying adaptive behavior and brain repair in adult mice.

Video: Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Aplicación de una conductancia del receptor NMDA en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de rata con la técnica de sujeción dinámica

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Investigación

Neurociencias

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

El estudio de la integración de los adultos nacidos en las neuronas

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Microdisección de captura por láser - Una demostración del aislamiento individual de dopamina neuronas y el Área ventral tegmental completo

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) neurotransmission is strongly associated with several central nervous system-associated diseases such as Parkinson&#39;s disease, attention-deficit-hyperactivity disorder and drug addiction1,2,3,4. Delineating disease mechanisms involving DA imbalance is critically dependent on animal models to mimic aspects of the diseases, and thus protocols that assess specific parts of the DA homeostasis are important to provide novel insights and possible therapeutic targets for these diseases.
Here, we present two useful experimental protocols that when combined provide a functional read-out of the DAergic system in mice. Biochemical and functional parameters on DA homeostasis are obtained through assessment of DA levels and dopamine transporter (DAT) functionality5. When investigating the DA system, the ability to reliably measure endogenous levels of DA from adult brain is essential. Therefore, we present how to perform high-performance liquid chromatography (HPLC) on brain tissue from mice to determine levels of DA. We perform the experiment on tissue from dorsal striatum (dStr) and nucleus accumbens (NAc), but the method is also suitable for other DA-innervated brain areas.
DAT is essential for reuptake of DA into the presynaptic terminal, thereby controlling the temporal and spatial activity of released DA. Knowing the levels and functionality of DAT in the striatum is of major importance when assessing DA homeostasis. Here, we provide a protocol that allows to simultaneously deduce information on surface levels and function using a synaptosomal6 DA uptake assay.
Current methods combined with standard immunoblotting protocols provide the researcher with relevant tools to characterize the DAergic system.

Synaptosomal dopamine uptake and high-performance liquid chromatography analysis represent experimental tools to investigate dopamine homeostasis in mice by assessing the function of the dopamine transporter and levels of dopamine in striatal tissue, respectively. Here we present protocols to measure dopamine tissue content and assess the functionality of the dopamine transporter.

Evaluación de la Homeostasis dopaminérgica en ratones por medio de análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento y absorción de la dopamina Synaptosomal

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions in the immature and adult brain. Here we describe a zinc histochemical staining procedure that reveals differences in staining patterns among different layers and brain regions. Others have utilized this procedure not only to reveal the distribution of zinc-containing neurons and circuits in the brain, but also to successfully delineate areal and laminar boundaries in the developing and adult brain in several species. Here we illustrate this staining procedure with images from developing and adult ferret brains. We reveal a zinc-staining pattern that serves as an anatomical marker of areas and layers, and can be reliably used to distinguish visual cortical areas in the developing and adult visual cortex. The main goal of this protocol is to present a histochemical method that allows the accurate identification of layers and regions in the developing and adult brain where other methods fail to do so. Secondarily, in conjunction with densitometric image analysis, this method allows one to assess the distribution of synaptic zinc to reveal potential changes throughout development. This protocol describes in detail the reagents, tools, and steps necessary to successively stain frozen brain sections. Although this protocol is described using ferret brain tissue, it can easily be adapted for use in rodents, cats, or monkeys as well as in other brain regions.

We describe a histochemical procedure that reveals characteristic laminar and areal zinc staining patterns in different brain regions. The zinc-staining pattern may be used in conjunction with other anatomical markers to reliably distinguish layers and regions in the developing and adult brain.

Uso de Zinc sináptica histoquímica para revelar las diferentes regiones y láminas en el cerebro en desarrollo y adulto

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...