该协议展示了如何使用活检衍生的肠道类器官和器官芯片技术来生成生理相关的肠道芯片，然后可用于预测药代动力学和药物相互作用并研究肠上皮屏障功能障碍。将类器官结合在器官芯片技术中使我们能够重现肠上皮的复杂性。此外，它还可以对机械线索、流量分布和生化梯度进行更好的实验控制。
该方法模拟人体肠道的复杂生理学，从而更好地了解正常和病理肠道功能的细胞和分子基础。这有助于更好地预测药代动力学和药效学以及潜在的候选药物，以防止炎症损伤。种子设定是协议中的关键步骤。
肠道类器官碎片的过度碎裂或不准确的接种密度可能会损害上皮屏障的发育和分化。首先，从静态类器官培养物中吸出培养基。从足够的孔中回收培养基，以实现每毫升800万个细胞的最终接种密度。
向每个孔中加入500微升冰冷的BMM解离溶液，并将溶解的BMM附着在孔表面。将悬浮液收集到15毫升低蛋白结合管中并将其放在冰上。每 15 分钟轻轻摇动试管一小时。
在4摄氏度下以300倍G离心5分钟，得到类器官沉淀。如果在沉淀上方观察到透明的凝胶层，请从管中吸出溶液。重悬沉淀并加入等体积的BMM解离溶液。
在冰上孵育10分钟并离心。重复直到没有溶解的BMM残留物。然后弃去上清液并将沉淀重悬于两毫升类器官消化溶液中。
将试管在 37 摄氏度下孵育一到三分钟，然后加入 8 毫升高级 DMEM F12 以停止酶促反应。将沉淀离心并重悬于完整的类器官生长培养基中，以达到每毫升800万个细胞。在无菌1.5毫升低蛋白结合管中等分360微升。
接下来，从包被芯片的顶部通道中取出培养基，并加入30微升细胞悬液。将芯片在 37 摄氏度下孵育过夜，将类器官片段粘附到膜上。向顶部入口储液槽中加入三毫升预平衡的完整类器官生长培养基，在底部入口储液槽中加入三毫升预平衡的内皮细胞生长培养基。
在各自的顶部和底部出口储液槽中加入 300 微升相同的培养基。将携带便携式模块的托盘转移到培养模块中。在培养模块上，重复运行素数循环，直到形成足够的液滴以成功连接芯片。
然后将芯片托架滑入便携式模块。然后开始长达两小时的调节周期，对便携式模块和芯片中的培养基加压，之后编程条件将恢复。接下来，更改拉伸设置并启动区域性模块。
24小时后，以10%的拉伸和相同的频率重复该循环。为了制备给药介质或载体对照，在完整的类器官生长培养基和内皮细胞生长培养基中稀释CYP诱导剂储备溶液或DMSO。暂停培养模块并将托盘带到生物安全柜。
用两毫升带有诱导器或车辆控制的计量介质替换所有入口和出口储液罐中的培养基。将便携式模块放回培养模块，并以每小时 30 微升的速度重新启动流量。每24小时用新鲜制备的诱导溶液替换培养基，并继续培养48至72小时。
然后将托盘带到生物安全柜中，并从所有储液器中吸出加药介质。用温热的高级DMEM F12培养基清洗并更换顶部入口储液器，用内皮细胞生长培养基更换底部储液器。用一毫升探针基板溶液替换洗涤介质。
以每小时 1， 000 微升的高流速灌注芯片 5 分钟，然后吸出顶部和底部出口储液罐。将芯片放回培养模块，并在每小时300微升的恒定流量下孵育一小时。治疗一小时后，停止流动并将托盘带到生物安全柜。
从顶部出口储液器收集 100 微升流出物，并将其添加到装有 200 微升终止溶液的管中。立即将试管放在干冰上，并将样品储存在零下80摄氏度。用200微升无菌DPBS洗涤两个通道。
然后用 200 微升过滤移液器吸头堵住底部通道出口。通过底部通道灌注50微升解离溶液，并在室温下孵育两分钟。确保内皮细胞完全分离，并通过移液从通道中除去解离溶液。
重复洗涤。接下来，堵塞顶部通道出口并灌注 75 微升蛋白质裂解缓冲液。保持移液器吸头插入并在室温下孵育五分钟。
通过移液5至10次将细胞裂解物收集在1.5毫升管中。重复灌注和收集以获得细胞的完全分离，并将裂解物储存在零下80摄氏度直至分析。对于RNA裂解，在使用150微升RNA裂解缓冲液时遵循相同的程序。
首先，通过在脱气的内皮细胞生长培养基中稀释储备溶液来制备干扰素γ给药溶液。在生物安全柜中，从底部通道入口储液器中取出培养基，每天用三毫升加样溶液替换。然后将托盘放入培养模块中，并以每小时1， 000微升的高流速灌注芯片五分钟。
将流速切换到每小时60微升并继续流体培养。将每孔100微升DPBS加入96孔黑壁板中。使用多通道移液器，将所有储层的50微升流出物添加到相应的孔中。
为了制备标准曲线，在DPBS中对含有每毫升100微克三千道尔顿葡聚糖级联蓝的培养基进行三倍稀释。然后使用DPBS中内皮细胞生长培养基的三倍稀释度进行连续妄想。十二指肠芯片中代表小肠结构的绒毛样结构突出了十二指肠和结肠芯片的独特形态特征。
在暴露于细胞色素P450诱导剂利福平和维生素D3的十二指肠芯片中，药物代谢酶细胞色素P450 3A4的mRNA基因表达升高，细胞色素P450酶的催化活性增强，表明所有三种类器官供体的诱导反应均适当。用干扰素γ处理结肠芯片的上皮单层时，观察到细胞形态受损和柱状上皮缺失。此外，与载体对照相比，用干扰素γ处理导致紧密和贴壁连接蛋白的细胞质信号增加，显示紧密连接标志物ZO-1和claudin 4的位移以及occludin和E-钙粘蛋白的内化。
在结肠芯片上刺激干扰素γ48小时后，观察到上皮旁细胞通透性显着增加。类似地，干扰素γ诱导细胞凋亡的激活，由裂解的半胱天冬酶3的细胞内含量增加所指示。干扰素γ诱导结肠芯片中促炎分子的极化分泌，如VCAM-1和白细胞介素-6的基底外侧分泌以及ICAM-1和血清淀粉样蛋白A的顶端分泌所示。
在成功建立肠道芯片后，我们可以研究肠道的吸收、运输和代谢、营养水平和肠道激素分泌、宿主微生物病原体相互作用、药物安全性和有效性、患者特异性疾病机制以及对治疗的反应。
