在生物安全3级（BSL-3）条件下使胃肠道类器官适应病原体感染和单细胞测序

该协议使我们能够了解人类肠道上皮中存在的单个细胞类型如何对病毒感染做出反应。我们在这里提出了三种独立的方法来播种人类肠道类器官，以解决感染途径如何影响细胞的反应。我们重点介绍了如何为单细胞RNA测序制备样品，同时考虑到在处理3类病原体时需要遵守的生物安全法规。

这种方法可以很容易地适应其他病原体和类器官培养物。最重要的考虑因素是确保您的类器官模型与所选的播种方法完全分化，并且可以支持病毒感染。在收获受感染的类器官之前，从零下80摄氏度取出单细胞凝胶珠，并将其加热至室温。

此外，按照制造商的说明书所述，将RT试剂，还原剂B和RT酶C平衡至室温，并重悬模板开关寡核苷酸。接下来，要收集感染BSL-3病原体的3D类器官，请从培养箱中取出细胞培养板并将其置于细胞培养罩中。然后使用P1000移液器，从24孔板的每个孔中取出分介质，向每个孔中加入500微升冰冷PBS并在室温下孵育三分钟。

接下来，为了完全破坏细胞外基质溶液，上下移液10次以重悬PBS，细胞外基质和类器官，然后将重悬的类器官转移到15毫升的锥形管中并将管子放在冰上。将每种感染情况收集在单独的15毫升锥形管中。换手套后，清洁管子的外部，并将管子从细胞培养罩中取出。

旋转样品五分钟。将管子移回细胞培养罩并取出PBS，避免从管底部重悬类器官沉淀。接下来，将沉淀重悬于一毫升解离酶中。

然后换手套，清洁试管，并将样品在37摄氏度下孵育30分钟。在孵育过程中，每10分钟将管子移回细胞培养罩，并通过上下移液来重悬类器官。为了确定类器官是否解离成单个细胞，使用P10移液管将10微升的类器官悬浮液放入一次性塑料细胞计数器载玻片中，然后用透明胶带密封样品输入端口。

换手套后，清洁细胞计数器的外部并使用明场显微镜，确认产生了单个细胞悬浮液。在确认单细胞悬浮液后，通过加入一毫升含有10%FBS的DMEM F12培养基并上下移液10次来停止消化。然后更换手套，清洁试管并旋转样品。

离心后，小心地除去含有解离酶的培养基，注意不要干扰底部的细胞沉淀。然后将单个细胞重悬于含有0.1%BSA的最小体积PBS中。将细胞悬浮液通过过滤器进入FACS管以除去大团块后，将管放在冰上。

接下来，为了确定每微升的细胞数，将10微升的细胞悬浮液加入一次性塑料细胞计数室中。然后用透明胶带密封样品输入端口，然后将样品从细胞培养罩中取出。换手套，清洁细胞计数室，然后使用明场显微镜计数细胞数量。

接下来，在细胞培养罩内，根据制造商的说明，根据实验中的样品数量，在1.5毫升管中制备RT试剂，模板切换寡核苷酸，还原剂B和RT酶C的预混合物。对于每个样品，将33.4微升的预混液等分到PCR管中，然后根据目标细胞数将细胞和水加入预混液中。换手套后，将单细胞控制器移入细胞培养罩并准备芯片。

接下来，将单细胞芯片加入芯片支架中，并用50%甘油填充未使用的通道。根据制造商的说明，将预混液、珠子和隔油添加到包含样品的通道中，并用垫圈覆盖芯片。将芯片加载到控制器中后，启动程序。

程序完成后，取出芯片和垫圈，然后使用多通道移液器将100微升乳液转移到清洁PCR管中。确保每种乳液具有均匀的白色，表明已经发生了完整的乳液。换手套并清洁试管后，将PCR试管转移到PCR机上并开始程序。

在PCR运行结束时，大多数包膜病毒将被灭活。这里显示了分裂后类器官第一天、第三天、第五天和第七天的代表性明场图像。平均而言，当中心变暗时，类器官每周分裂一次。

通过改变培养基条件，去除Wnt-3a并减少R-spondin和noggin，可以模仿在人体肠道内发现的细胞复杂性。通常，向Paneth细胞，杯状细胞和肠细胞分化需要四天的分化培养基。对SARS-CoV-2感染的人结肠和回肠衍生类器官的单细胞测序数据分析表明，只有人类肠上皮细胞亚群在12小时和24小时后支持SARS-CoV-2感染。

对SARS-CoV-2感染结肠衍生类器官的先天免疫反应的分析表明，SARS-CoV-2在受感染细胞中诱导促炎信号级联反应，而未感染的旁观者细胞显示干扰素介导的免疫反应。此外，单细胞RNA测序显示，由于病毒介导的途径阻塞，受感染的细胞无法感知干扰素。类器官必须分化良好且健康。

这可以通过在感染前通过qPCR确定细胞分化标志物的水平来控制。如果细胞分化不充分，它们将不支持病毒感染并导致无信息的结果。这种技术使我们能够从腔内和组织侧感染粘膜。

这是非常关键的，因为它使我们能够解开粘膜表面使用的机制，以容忍一侧的肮脏环境和另一侧的无菌环境。