来自沙柯玛患者衍生异种移植物的肿瘤启动细胞的分离和表征

我们发现，HLA-I在具有干细胞特性和肿瘤启动能力的癌细胞亚细胞中表观遗传性受到抑制。HLA-I下位与免疫逃逸直接相关，为癌症干细胞提供生存优势，使HLA-I负性成为这些细胞的准确功能标记。演示这个程序的将是苏迪·伊扎德梅尔，一个来自我们实验室的博士后。

采集样品后，将组织放在消毒的生物安全柜中，将组织放在100毫米培养皿中，并在盘中加入500微升无菌PBS。使用无菌手术刀机械地将组织三叶草分割成小块，直到没有大于0.1毫米的碎片。通过 35 微米孔细胞过滤器将整个 500 微升 PBS 体积转移到 50 毫升锥形管中。

再在组织片段中加入500微升PBS，然后再次切碎组织。然后通过细胞滤压器将上清液过滤到同一个收集管中，然后继续切碎组织片段，直到样品完全分离。收集最后一卷细胞后，通过离心将肿瘤细胞向下旋转，并在五毫升的造血缓冲液中重新悬浮颗粒。

在室温下五分钟后，用另一个离心收集细胞，再用五毫升PBS洗涤颗粒。将颗粒重新悬浮在PBS的一毫升中，并计算可行的细胞。将细胞稀释到每200微升PBS浓度的10倍至第七细胞，并在轻轻混合的细胞中加入200微升的基底膜基质。

然后将细胞悬浮基基基膜基质皮下注射到NONO scid伽马小鼠的侧翼，每周两次检查注射部位肿瘤的生长。当肿瘤直径达到一厘米时，将肿瘤切成两半，并一夜之间用4%的半甲醛固定一半，进行组织学分析。处理肿瘤的后半部分，刚刚证明实现单细胞悬浮，并稀释细胞到2倍10至6个细胞每毫升PBS补充5%FBS浓度。

在将细胞悬浮液分到一个等型对照和一个抗体管之间之前，将细胞在冰上保持30分钟。注意每个管中的细胞数量，将抗体管中的细胞与抗HLA抗体混合，将等型控制管中的细胞与适当的抗同型控制抗体混合，在冰上孵育90分钟。在孵育结束时，通过离心收集两个细胞群，然后通过离心收集两个10毫升的PBS洗涤。

第二次洗涤后，将每毫升DAPI10微克的颗粒重新悬浮到每毫升浓度10至7个细胞的1倍。然后通过35微米孔隙滤株将每个细胞悬浮液过滤到单独的12-75毫米聚苯乙烯管中。在荧光激活细胞分选后，将HLA-I阴性细胞和阳性细胞群稀释到个体10至第五细胞浓度，每分集15毫升的磁圈生长介质中。

连续稀释细胞1倍至第四、10至第三，10至次浓度在15毫升新鲜弧圈生长介质中，每次稀释每井一个96井超低附细胞培养板，再增加100微升细胞。将板放入37摄氏度、5%的二氧化碳细胞培养箱中，每天通过光显微镜监测北极层的形成，并在每孔中加入新鲜的基本纤维细胞生长因子和表皮生长因子，每三天不改变一次培养基。三周后，计算每个细胞稀释HLA-I阴性细胞和HLA-I-阳性细胞的弧圈-正孔和星圈-负孔数，以便根据泊松概率分布计算球体形成细胞频率。

通常，人类患者衍生的肉瘤异种移植由两个不同的HLA-I阳性和负性群体组成，其组织学与父母原发性肿瘤所证明的相似。如证明，肉瘤患者衍生异种移植肿瘤启动细胞的荧光活性细胞分类有助于从亲细胞群体中富集大量HLA-I阴性细胞。HLA-I-阴性细胞能够形成球体，初始输入只有10个细胞，并且比HLA-I-阳性肉瘤患者到达异种移植肿瘤启动细胞表现出更高的肿瘤形成能力。

将相同数量的HLA-I阴性细胞和阳性细胞皮下注射到同一小鼠的对侧翼，表明HLA-I阴性细胞具有显著提高的肿瘤形成能力。而由HLA-I阴性组和正性亚细胞形成的异种移植体是细胞异质肿瘤。此外，肿瘤启动细胞的基因表达分析表明，HLA-I-阴性细胞表达干细胞分化标记，可诱导分化沿脂质和骨质通路，表现出强油-红-O和阿里扎林-红-S染色和培养。

这种方法可用于分离各种人类癌症中的癌症干细胞。例如，分子碳化，通过下一代测序，可以揭示治疗性细胞靶向的常见标记。我们的发现表明，HLA-I的恢复是功能单元免疫细胞增强策略成功的关键一步。