Abbiamo scoperto che l'HLA-I è epigeneticamente regolato in una sottopopolazione di cellule tumorali che mostrano proprietà delle cellule staminali e capacità di inizio del tumore. L'downregulation HLA-I è direttamente correlata alla fuga immunitaria, fornendo vantaggi di sopravvivenza per le cellule staminali tumorali, rendendo quindi la negatività HLA-I un marcatore funzionale accurato per queste cellule. A dimostrare la procedura sarà Sudeh Izadmehr, un postdoc del nostro laboratorio.
Al momento dell'acquisizione del campione, mettere il tessuto in una piastra di Petri da 100 millimetri in un armadietto di biosicurezza sterilizzato e aggiungere 500 microlitri di PBS sterile alla piastra. Utilizzare un bisturi sterile per triturare meccanicamente il tessuto in piccoli pezzi fino a quando nessun frammento è più grande di 0,1 millimetri. Trasferire l'intero volume di PBS da 500 microlitri attraverso un filtro a celle a poro da 35 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri.
Aggiungere altri 500 microlitri di PBS ai frammenti di tessuto e tritare di nuovo i tessuti. Quindi filtrare il supernatante attraverso il filtro cellulare nello stesso tubo di raccolta e continuare a tritare i pezzi di tessuto fino a quando il campione non è completamente dissociato. Quando l'ultimo volume di cellule è stato raccolto, spingi giù le cellule tumorali per centrifugazione e riasspensi il pellet in cinque millilitri di tampone di emolisi.
Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione e lavare il pellet con altri cinque millilitri di PBS. Sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di PBS e contare le cellule vitali. Diluire le cellule a una per 10 alla settima cellule per 200 microlitri di concentrazione di PBS sul ghiaccio e aggiungere 200 microlitri di matrice di membrana basale alle cellule con miscelazione delicata.
Quindi iniettare la matrice della membrana cellulare sospensione-basamento sottocutaneamente nel fianco di un topo gamma scid NOD e controllare la crescita del tumore nel sito di iniezione due volte a settimana. Quando il tumore raggiunge un centimetro di diametro, tagliare il tumore a metà e fissare metà dello xenoinnesto con il 4% di paraformaldeide durante la notte per l'analisi istologica. Elaborare la seconda metà del tumore come appena dimostrato per ottenere una sospensione a singola cellula e diluire le cellule a due volte 10 alle sei cellule per millilitro di PBS integrato con una concentrazione FBS del 5%.
Mantenere le cellule sul ghiaccio per 30 minuti prima di dividere la sospensione cellulare tra un controllo dell'isotipo e un tubo anticorpale. Si noti il numero di cellule in ogni tubo e mescolare le cellule nel tubo anticorpale con anticorpi anti-HLA e le cellule nel tubo di controllo dell'isotipo con un anticorpo di controllo anti-isotipo appropriato per un'incubazione di 90 minuti sul ghiaccio. Alla fine dell'incubazione, raccogliere entrambe le popolazioni cellulari per centrifugazione, seguite da due lavaggi PBS da 10 millilitri per centrifugazione.
Dopo il secondo lavaggio, sospendere di nuovo i pellet in 10 microgrammi per millilitro di DAPI a una concentrazione di uno per 10 fino alle sette cellule per millilitro. Quindi filtrare ogni sospensione cellulare attraverso un filtro poro da 35 micrometri in singoli tubi di polistirolo da 12 per 75 millimetri. Dopo lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, diluire le popolazioni di cellule HLA-I-negative e positive a singole concentrazioni di una volta 10-quinta cella in 15 millilitri del mezzo di crescita della sarcosfera per sottoinsieme.
Diluire serialmente le cellule a una per 10 alla quarta, 10 alla terza e 10 alla seconda concentrazione in 15 millilitri di mezzo di crescita della sarcosfera fresca per diluizione, e aggiungere 100 microlitri di cellule da ogni diluizione ad ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare ad attacco ultra-bassa da 96 po 'per diluizione. Posizionare le piastre in un incubatore di coltura cellulare di 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, monitorando quotidianamente la formazione della sarcosfera mediante microscopia leggera e aggiungendo un nuovo fattore di crescita dei fibroblasti di base e un fattore di crescita epidermico a ciascun pozzo senza cambiare il mezzo ogni tre giorni. Dopo tre settimane, conta il numero di pozzi positivi alla sarcosfera e sarcosfera-negativi per ogni diluizione cellulare delle cellule HLA-I-negative e HLA-I-positive per consentire il calcolo della frequenza cellulare che forma la sfera basata su una distribuzione di probabilità di Poisson.
Tipicamente, gli xenografti di sarcoma derivati dal paziente umano consistono in due distinte popolazioni HLA-I-positive e negative, con un'istologia simile a quella dimostrata dal tumore primario parentale. Lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza delle cellule che iniziano il tumore dello xenografto derivato dal paziente sarcoma, come dimostrato, facilita l'arricchimento di un elevato numero di cellule HLA-I-negative dalla popolazione delle cellule parentali. Le cellule HLA-I-negative sono in grado di formare sfere con un input iniziale di appena 10 cellule e mostrano una maggiore capacità di formazione tumorale rispetto al paziente con sarcoma positivo HLA-I arrivate cellule che iniziano il tumore allo xenografto.
L'iniezione dello stesso numero di cellule negative e positive HLA-I per via sottocutanea nei fianchi opposti dello stesso topo dimostra che le cellule HLA-I-negative possiedono una capacità di formazione tumorale significativamente più elevata. Mentre gli xenoinnesti formati da sottopopolazioni sia negative che positive HLA-I sono tumori eterogeni cellulari. Inoltre, l'analisi dell'espressione genica delle cellule che iniziano il tumore rivela che le cellule HLA-I-negative esprimono marcatori di differenziazione delle cellule staminali e possono essere indotte a differenziarsi lungo le vie lipogeniche e osteogeniche, dimostrando una forte colorazione e coltura oil-red-o e alizarin-rosso-s.
Questo metodo può essere utilizzato per isolare le cellule staminali tumorali in vari tumori umani. La carbonizzazione molecolare, ad esempio, entro il sequenziamento di nuova generazione può rivelare marcatori comuni per indirizzare le cellule terapeuticamente. La nostra scoperta dimostra che il ripristino dell'HLA-I è un passo fondamentale per il successo delle strategie di potenziamento delle cellule immunitarie dell'unità funzionale.
