Мы обнаружили, что HLA-I эпигенетически вниз регулируется в субпопуляции раковых клеток, которые демонстрируют свойства стволовых клеток и опухоли инициируя способность. HLA-I downregulation напрямую связан с иммунным побегом, обеспечивая преимущества выживания для раковых стволовых клеток, что делает HLA-I отрицательность точным функциональным маркером для этих клеток. Демонстрация процедуры будет Sudeh Izadmehr, postdoc из нашей лаборатории.
После приобретения образца поместите ткань в 100-миллиметровую чашку Петри в стерилизованный био-кабинет безопасности и добавьте в блюдо 500 микролитров стерильного PBS. Используйте стерильный скальпель, чтобы механически тритурировать ткань на мелкие кусочки, пока ни один фрагмент не будет больше 0,1 миллиметра. Перенесите весь 500-микролитровый объем PBS через 35-микрометровый ситечко клеток поры в 50-миллилитровую коническую трубку.
Добавьте еще 500 микролитров PBS к фрагментам тканей и снова измельчите ткани. Затем процедите супернатант через клеточный ситечко в ту же трубку сбора, и продолжайте фарш части ткани, пока образец полностью разобщены. Когда последний объем клеток был собран, спина вниз опухолевых клеток центрифугации, и повторно приостановить гранулы в пять миллилитров гемолита буфера.
После пяти минут при комнатной температуре, собирать клетки с другой центрифугации, и мыть гранулы с еще пять миллилитров PBS. Повторно приостановить гранулы в один миллилитр PBS, и подсчитать жизнеспособные клетки. Разбавить клетки в один раз от 10 до седьмой клетки на 200 микролитров концентрации PBS на льду, и добавить 200 микролитров мембранной матрицы подвала к клеткам с нежным смешивания.
Затем вводите клеточной подвески-подвал мембраны матрицы подкожно в фланг NOD scid гамма-мышь, и проверить рост опухоли в месте инъекции два раза в неделю. Когда опухоль достигает одного сантиметра в диаметре, разрежьте опухоль пополам, и исправить половину ксенотрансплантата с 4%paraformaldehyde ночь для гистологического анализа. Процесс второй половины опухоли, как только что показали для достижения одной клеточной суспензии, и разбавить клетки в два раза от 10 до шести клеток на миллилитр PBS дополняется 5%FBS концентрации.
Поддерживайте клетки на льду в течение 30 минут, прежде чем разделить подвесную клетку между одним изотипом управления и одной трубки антитела. Обратите внимание на количество клеток в каждой трубке, и смешать клетки в трубке антитела с анти-HLA антитела и клетки в изотипной трубки управления с соответствующим анти-изотип контроля антител для 90-минутной инкубации на льду. В конце инкубации, собирать обе популяции клеток центрифугации, а затем два 10-миллилитров PBS моет центрифугации.
После второй стирки повторно приостанавливайте гранулы в 10 микрограммах на миллилитр ДАПИ до 10-7 клеток на миллилитр. Затем фильтруй каждую клеточное суспензию через 35-микрометровый поры в отдельные полистироловые трубки 12 на 75 миллиметров. После флуоресценции активированной сортировки клеток, разбавить HLA-I-отрицательных и положительных популяций клеток для отдельных один раз от 10 до пятой концентрации клеток в 15 миллилитров саркосферы роста среды на подмножество.
Серийно разбавляют клетки до одного раза от 10 до четвертого, от 10 до третьего и от 10 до второй концентрации в 15 миллилитров свежей среды роста саркосферы на разбавление, и добавляют 100 микролитров клеток от каждого разбавления до каждого колодец одного 96-ну ультра-низкой пластины клеточной клетки на разбавление. Поместите пластины в 37-градусный по Цельсию, 5%carbon dioxide клеточный инкубатор культуры, мониторинг формирования саркосферы ежедневно световой микроскопии и добавление свежих основных фактор роста фибробластов и эпидермального фактора роста к каждому хорошо, не меняя среды каждые три дня. Через три недели подсчитайте количество саркосферно-положительных и саркосферно-отрицательных скважин для каждой клеточной разбавления как HLA-I-отрицательных, так и HLA-I-положительных клеток, чтобы позволить расчет частоты шарообразующих клеток на основе распределения вероятности Пуассона.
Как правило, ксенотрансплантаты, полученные пациентом, состоят из двух различных HLA-I-положительных и отрицательных популяций, с аналогичной гистологией, продемонстрированой родительской первичной опухолью. Флуоресценция активированных клеток сортировки саркомы пациента полученных ксенотрансплантатов опухолевых инициаторных клеток, как попродемонстрировано облегчает обогащение большого числа HLA-I-отрицательных клеток из родительской популяции клеток. HLA-I-отрицательные клетки способны формировать сферы с первоначальным входом всего 10 клеток и обладают более высокой способностью образования опухоли, чем HLA-I-положительный пациент саркомы прибыл ксенотрансплантат опухолевых инициации клеток.
Инъекция такого же количества отрицательных и положительных клеток HLA-I подкожно в противоположные фланги той же мыши показывает, что HLA-I-отрицательные клетки обладают значительно более высокой способностью образования опухоли. В то время как ксенотранспланты, образованные как HLA-I отрицательными, так и положительными субпопуляциями, являются клеточно неоднородными опухолями. Кроме того, анализ экспрессии генов опухолевых инициируя клеток показывает, что HLA-I-отрицательные клетки выражают маркеры дифференциации стволовых клеток и могут быть индуцированы, чтобы дифференцировать по липогенным и остеогенным путям, демонстрируя сильное окрашивание и культуру Oil-Red-O и Alizarin-Red-S.
Этот метод может быть использован для изоляции раковых стволовых клеток при различных видах рака человека. Молекулярная карбонизация, например, при секвенировании следующего поколения может выявить общие маркеры для ориентации клеток терапевтически. Наше открытие показывает, что восстановление HLA-I является важным шагом для успеха функциональных стратегий увеличения иммунных клеток единицы.
