HLA-I'ın kök hücre özellikleri ve tümör başlatma kapasitesi gösteren kanser hücrelerinin alt popülasyonunda epigenetik olarak aşağı doğru düzenlendiğini keşfettik. HLA-I downregulation doğrudan bağışıklık kaçış ile ilgilidir, kanser kök hücreleri için sağkalım avantajları sağlayan, bu nedenle HLA-I negatifliği bu hücreler için doğru bir fonksiyonel belirteç yapma. Prosedürü gösteren Sudeh Izadmehr, bizim laboratuvar bir postdoc olacaktır.
Numunenin alınmasından sonra, sterilleştirilmiş bir biyo güvenlik kabininde 100 milimetrelik Petri kabına doku yerleştirin ve tabağa 500 mikrolitre steril PBS ekleyin. Hiçbir parça 0,1 milimetreden büyük olana kadar dokuyu mekanik olarak küçük parçalara dönüştürmek için steril bir neşter kullanın. PBS'nin 500 mikrolitrelik hacminin tamamını 35 mikrometrelik gözenek hücresi süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Doku parçalarına 500 mikrolitre pbs daha ekleyin ve dokuları tekrar doğrama. Daha sonra aynı toplama tüpü içine hücre süzgeci ile supernatant filtre ve örnek tamamen ayrıştırılır kadar doku parçaları kıyma devam edin. Hücrelerin son hacmi toplandığında, santrifüj ile tümör hücreleri aşağı spin, ve hemoliz tampon beş mililitre pelet yeniden askıya.
Oda sıcaklığında beş dakika sonra, başka bir santrifüj ile hücreleri toplamak ve PBS başka bir beş mililitre ile pelet yıkayın. PBS bir mililitre pelet yeniden askıya almak ve canlı hücreleri saymak. Hücreleri buzüzerindeki 200 mikrolitre PBS konsantrasyonu başına 10 ila yedinci hücrelere kadar seyreltin ve hafif karıştırma ile hücrelere 200 mikrolitre bazal membran matris ekleyin.
Sonra bir NOD scid gama farenin kanadına hücre süspansiyon-bodrum membran matris subkutan enjekte ve enjeksiyon yerinde iki kez bir hafta tümörün büyümesini kontrol edin. Tümör çapı bir santimetre ulaştığında, yarısında tümör kesmek ve histolojik analiz için bir gecede% 4 paraformaldehit ile ksenogreft yarısını düzeltmek. Sadece tek bir hücre süspansiyon elde etmek için gösterildiği gibi tümörün ikinci yarısında süreci, ve pbs mililitre başına altı hücre için iki kez 10 hücreleri seyreltmek 5% FBS konsantrasyonu ile desteklenmektedir.
Bir izole kontrol ve bir antikor tüpü arasında hücre süspansiyon bölmeden önce 30 dakika boyunca buz üzerindeki hücreleri koruyun. Her tüpteki hücre sayısını not edin ve antikor tüpündeki hücreleri anti-HLA antikor ile karıştırın ve izotip kontrol tüpündeki hücreleri buz üzerinde 90 dakikalık bir kuluçka için uygun bir anti-izotip kontrol antikoru ile karıştırın. Kuluçka sonunda, her iki hücre popülasyonunu da santrifüj le toplar, ardından santrifüj le iki adet 10 mililitrelik PBS yıkınır.
İkinci yıkamadan sonra, dapi mililitre başına 10 mikrogram pelet yeniden askıya mililitre konsantrasyonu başına yedi hücre için bir kez 10. Daha sonra her hücre süspansiyonuna 35 mikrometrelik gözenek süzgeciyle 12'ye 75 milimetrelik polistiren tüplere süzün. Floresan aktive hücre sıralamasından sonra, HLA-I-negatif ve pozitif hücre popülasyonlarını tek tek 10 kez, alt küme başına sarkosfer büyüme ortamının 15 mililitresinde beşinci hücre konsantrasyonlarına seyreltin.
Seri olarak hücreleri 10'dan 4'e, 10'dan üçüncüye ve 10'a ikinci konsantrasyonlarda seyreltme başına 15 mililitre taze sarkosfer büyüme ortamına seyreltin ve her seyreltmeden seyreltme başına 96-iyi ultra düşük bağlanma hücre kültür plakasının her bir kuyuya 100 mikrolitre hücre ekleyin. Plakaları 37 derecelik bir santigrat, %5 karbondioksit hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin, ışık mikroskobu ile sarkosfer oluşumunu günlük olarak izleyerek ve her kuyuya her üç günde bir ortayı değiştirmeden taze temel fibroblast büyüme faktörü ve epidermal büyüme faktörü ekleyerek. Üç hafta sonra, hem HLA-I-negatif hem de HLA-I-pozitif hücrelerin inseyreltilmesi için sarkosfer-pozitif ve sarkosfer-negatif kuyuların sayısını sayarak Küre oluşturan hücre frekansının Poisson olasılık dağılımına dayalı olarak hesaplanmasına izin verin.
Tipik olarak, insan hasta kaynaklı sarkopara ksenogreftler iki ayrı HLA-I-pozitif ve negatif popülasyondan oluşur, buna benzer histoloji ebeveyn primer tümörü ile gösterilmiştir. Sarkom hasta kaynaklı ksenogreft tümör başlatan hücrelerin floresan-aktive hücre sıralama gösterildiği gibi ebeveyn hücre popülasyonundan HLA-I-negatif hücrelerin yüksek sayıda zenginleştirme kolaylaştırır. HLA-I-negatif hücreler 10 hücregibi az bir başlangıç girişi ile küreler oluşturmak ve HLA-I-pozitif sarkom hasta ksenogreft tümör başlatan hücreler geldi daha yüksek bir tümör oluşum yeteneği sergilemek edebiliyoruz.
Aynı farenin karşıt yanlarına deri altı olarak aynı sayıda HLA-I negatif ve pozitif hücre enjeksiyonu HLA-I-negatif hücrelerin önemli ölçüde daha yüksek tümör oluşum yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Hem HLA-I negatif hem de pozitif alt popülasyonların oluşturduğu ksenogreftler hücresel heterojen tümörlerdir. Ayrıca, tümör başlatan hücrelerin gen ekspresyonu analizi HLA-I-negatif hücrelerin kök hücre farklılaşma belirteçleri ifade ve güçlü Oil-Red-O ve Alizarin-Red-S boyama ve kültür gösteren, lipojenik ve osteojenik yollar boyunca ayırt etmek için indüklenebilir ortaya koymaktadır.
Bu yöntem çeşitli insan kanserlerinde kanser kök hücreleri izole etmek için kullanılabilir. Moleküler karbonizasyon, örneğin, yeni nesil sıralama ile terapötik hücreleri hedeflemek için ortak belirteçleri ortaya çıkarabilir. Keşfimiz, HLA-I'ın restorasyonunun fonksiyonel ünite bağışıklık hücresi büyütme stratejilerinin başarısı için kritik bir adım olduğunu göstermektedir.
