背根神经节分离与原代培养对神经递质释放的研究

这种方法有助于回答感官研究领域的一些关键问题，如外周感知。这一技术的主要优点是，用最模拟生理状况的模型来研究感觉神经元的细胞机制。从两到三周大的老鼠的躯干中收集腰椎根。

首先沿着脊柱的两侧进行两次切口，一次横向切割，以标记腰椎的脊椎范围。然后，使用骨切钳去除脊柱的后肌。接下来，切除椎骨的后肢，露出脊髓。

然后使用解剖剪刀和钳子切除脊髓。通过计算上一根肋骨的椎骨来识别腰椎 DRG。此图显示了椎骨的位置。

使用微型剪刀收集从 L1 到 L6 的 12 个双边腰椎 DRG。去除任何附加的神经元纤维，以提高培养的纯度。将每个腰椎 DRG 转移到一个 35 毫米培养皿中，其中含有两毫升无冰冷血清介质。将含有 DRG 的 35 毫米培养皿转移到层罩中，用移液器用无血清介质清洗 DRG 三次。

使用无菌钳子将 DRG 移动到包含两毫升无菌胶原酶 1A 类型的新的 35 毫米培养盘中。将组织放在胶原酶溶液中，在37摄氏度的组织培养箱中放置30分钟，开始分离细胞。孵育后，去除胶原酶溶液，在汉克平衡盐溶液的两毫升中洗涤性干酶三次。

接下来，在培养皿中加入两毫升预预热0.05%的三辛EDTA，并像之前一样在培养箱中消化30分钟的 DRG。消化后，使用玻璃移液器将含 DRG 溶液的两毫升转移到 15 毫升离心管中。DRG 可能会粘在玻璃移液器上，因此应小心执行此步骤。

通过将含 DRG 溶液留在玻璃移液器的锥度端，并缓慢地（但无需暂停）将溶液转移到离心管中，可以避免实际损失。接下来，在摄氏4度下将溶液在290倍G下离心5分钟。离心后，去除上流剂，再加入两毫升无血清介质，重新下垂 DRG。

重复洗涤两次，使用两毫升预受的培养培养，在最后离心后重新暂停组织。使用先前准备的无菌火焰抛光移液器手动三角化 DRG 约 60 次。接下来，从CO2培养箱中去除一个涂有1毫升培养基的聚L-Lysine涂层24井板，其中含有1毫升培养基。

从菜中吸出孵化的培养培养。将 DRG 细胞从一只大鼠中播种到四口井中。这样，每井的播种密度约为50万个细胞。

第二天，用10微摩尔AraC和每毫升NGF100毫微克取代培养剂。在细胞电镀后的第三天，将培养素更改为0.5毫升的预预热无血清培养，并孵育一小时。在孵育过程中，在无RNase水的微升中加入50毫摩尔siRNA，每转染12.5微升无血清介质。

然后移液器2.5微升转染试剂进入10微升的无血清培养剂，每次转染。通过移液器混合两种溶液，并在室温下孵育这种混合转染溶液 10 分钟。10分钟后，将转染溶液加入含有 DRG 的 24 孔板的孔中，轻轻摇动混合。

经过6个小时的孵育，在每毫升NGF的每个细胞井中加入0.5毫升培养，20%FBS、10微摩尔阿拉克和100毫微克。最后，在37摄氏度的CO2培养箱中再孵育36小时。在电镀后的第六天和siRNA转染后72小时，将培养剂更改为200微升无血清介质。

经过30分钟的孵育，加入一微升的刺激化学物质，通过移液轻轻混合。此处使用 NPFFR2 激动剂、dNPA 和相应的车辆。在所需期间孵育后，从培养皿中收集培养基，并在5000次G下离心，在4摄氏度下5分钟，去除任何悬浮杂质。

从离心中收集上流液，并根据需要用磷酸盐缓冲盐水稀释。使用市售酶免疫测定试剂盒测定神经递质水平。第一天，箭头指示的单个神经元的细胞体附着在盘子的底部。

还存在箭头指示的胶质单元格。胶质细胞复制和扩展的过程，以包围感觉神经元的细胞体第二天，这个过程甚至更突出的第三天。在另一种培养文化中，CGRP蛋白被染色，以揭示神经元的形状。

CGRP蛋白染色出现在感觉神经元的细胞质和轴突中。神经元和胶质细胞的核形态在染色达皮时是截然不同的。神经元的核比胶质细胞更大、更圆。

相比之下，胶质的核形状更椭圆形。一旦掌握，这项技术可以在两个半小时，如果它执行得当。看完这段视频后，你应该对如何解剖和培养后根结节有一个良好的理解，并用它来研究潜在的生理功能的工具。

不要忘记，使用原细胞比使用常规细胞系困难得多，而执行这些程序时，温和总是最好的方法。