Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación sensorial, como la nocicepción periférica. La principal ventaja de este técnico es que la investigación del mecanismo celular de las neuronas sensoriales con el modelo que más simula a la condición fisiológica. Recoger los ganglios de la raíz dorsal lumbar del tronco de una rata de dos a tres semanas de edad.
Comience haciendo dos cortes a lo largo de los lados de la columna vertebral y un corte lateral para marcar la extensión rostral de la columna lumbar. Luego, usa fórceps de corte óseo para eliminar los músculos dorsales de la columna vertebral. A continuación, retire la parte dorsal de las vértebras y exponga la médula espinal.
Luego usa tijeras de disección y fórceps para extirpar la médula espinal. Identifique el DRG lumbar contando las vértebras de la última costilla. Este diagrama muestra las posiciones de las vértebras.
Utilice micro tijeras para recoger el DRG lumbar bilateral de 12 P. Retire las fibras neuronales adheridas para mejorar la pureza del cultivo. Transfiera cada DRG lumbar a un plato de cultivo de 35 milímetros que contenga dos mililitros de medio libre de suero helado. Transfiera el plato de 35 milímetros que contiene DRG a una capucha laminar, y lave el DRG con un medio libre de suero tres veces por pipeta.
Utilice pinzas estériles para mover los DRG a un nuevo plato de cultivo de 35 milímetros que contenga dos mililitros de colágeno estéril tipo 1A. Coloque el tejido en solución de colagenasa en la incubadora de cultivo de tejido Celsius de 37 grados durante 30 minutos para comenzar la disociación de las células. Después de la incubación, retire la solución de colagenasa y lave el DRG tres veces en dos mililitros de la solución de sal equilibrada de Hank.
A continuación, agregue dos mililitros de 0,05% de trippsina preadmanientes al plato, y digiere el DRG en la incubadora durante 30 minutos como antes. Después de la digestión, utilice una pipeta de vidrio para transferir los dos mililitros de solución que contiene DRG a un tubo centrífugo de 15 mililitros. El DRG podría adherirse a la pipeta de vidrio por lo que este paso debe realizarse con cuidado.
La pérdida real se puede evitar manteniendo la solución que contiene DRG en el extremo cónico de la pipeta de vidrio, y transfiriendo la solución al tubo de centrífuga lentamente pero sin pausa. A continuación, centrifugar la solución a 290 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de centrifugar, retire el sobrenadante y agregue otros dos mililitros de medio libre de suero para resuspender el DRG.
Repita el lavado dos veces, utilizando dos mililitros de medio de cultivo preadizo para resuspender el tejido después de la centrifugación final. Utilice la pipeta de pulido de llama estéril previamente preparada para triturar manualmente el DRG aproximadamente 60 veces. A continuación, retire de la incubadora de CO2 una placa de poli-L-lisina recubierta de 24 pozos que contenga un mililitro de medio de cultivo por pozo.
Aspirar el medio de cultivo incubado del plato. Siembra las células DRG de una rata en cuatro de los pozos. Esto da una densidad de siembra de aproximadamente 500.000 células por pozo.
Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo por un medio complementado con 10 araC micromolares y 100 nanogramos por mililitro de NGF. En el tercer día después del enchapado celular, cambie el medio a 0,5 mililitros de medio preadniérico libre de suero, e incubar durante una hora. Durante la incubación, añada 50 siRNA militrolar en un microlitro de agua libre de RNase a 12,5 microlitros de medio libre de suero por transfección.
A continuación, pipetear 2,5 microlitros de reactivo de transfección en 10 microlitros de medio libre de suero para cada transfección. Mezclar ambas soluciones por pipeta e incubar esta solución de transfección mixta durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, agregue la solución de transfección en los pocillos de la placa de 24 pocillos que contiene DRG y mezcle agitando suavemente.
Después de una incubación de seis horas, añadir 0,5 mililitros de medio de cultivo con 20%FBS, 10 araC micromolares y 100 nanogramos por mililitro NGF en cada poc de células. Finalmente, incubar el DRG en una incubadora de CO2 de 37 grados Celsius durante otras 66 horas. En el día seis después del enchapado, y 72 horas después de la transfección del SIRNA, cambie el medio de cultivo a 200 microlitros de medio libre de suero.
Después de una incubación de 30 minutos, agregue un microlitro del químico de estimulación y mezcle suavemente por pipeteo. Aquí se utilizan el agonista NPFFR2, el dNPA y el vehículo correspondiente. Después de incubar durante el período requerido, recoger el medio de cultivo del plato de cultivo, y centrifugar a 5000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para eliminar cualquier impureza suspendida.
Recoger el sobrenadante de la centrifugación y diluir con solución salina tamponada con fosfato según sea necesario. Ensayo de los niveles de neurotransmisores con kits de inmunoensayos enzimáticos disponibles comercialmente. En el primer día, el cuerpo celular de una sola neurona indicada por la flecha estaba unido en la parte inferior de un plato.
También está presente una celda glial indicada por una punta de flecha. Las células gliales duplicaron y extendieron los procesos para rodear el cuerpo celular de la neurona sensorial en el segundo día, un proceso que fue aún más prominente en el tercer día. En otro cultivo, la proteína CGRP se tiñeba para revelar la forma de las neuronas.
La tinción de proteína CGRP aparece en el citoplasma y los axones de las neuronas sensoriales. Las morfologías nucleares de las neuronas y las células gliales son distintas cuando se tiñen con DAPI. Las neuronas tienen un núcleo más grande y más redondeado que las células gliales.
En comparación, los núcleos del glial son más ovalados en forma. Una vez masterada, esta técnica se puede hacer en dos horas y media si se realiza correctamente. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar y cultivar el ganglio de raíz dorsal, y utilizarlo como una herramienta para investigar las funciones fisiológicas subyacentes.
No olvide que trabajar con células primarias puede ser mucho más difícil que trabajar con líneas celulares regulares, y ser suave siempre es la mejor manera al realizar estos procedimientos.
