Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сенсорных исследований, таких как периферическое ноцицепция. Основным преимуществом этого технического является то, что исследование клеточного механизма сенсорных нейронов с моделью, которая наиболее имитирует физиологическое состояние. Соберите поясничный спинной корень ганглиев из ствола двух-трехнедельной крысы.
Начните с двух разрезов по бокам позвоночника и один боковой разрез, чтобы отметить ростральный размер поясничного отдела позвоночника. Затем используйте костно-резаные миппы для удаления спинных мышц позвоночника. Затем удалите спинную часть позвонков и обнажите спинной мозг.
Затем используйте ножницы и типсы для удаления спинного мозга. Определите поясничный DRG, подсчитав позвонки из последнего ребра. На этой диаграмме показаны положения позвонков.
Используйте микро ножницы для сбора 12 двусторонних поясничных DRG от L1 до L6. Удалите любые прикрепленные нейронные волокна, чтобы улучшить чистоту культуры. Перенесите каждый поясничный DRG на 35-миллиметровое культурное блюдо, содержащее два миллилитра среды, свободной от холодной сыворотки. Перенесите ДРГ-содержащую 35-миллиметровую тарелку в ламинарный капюшон и трижды промойте DRG с помощью безотовилочной среды пипеткой.
Используйте стерильные пинцеты, чтобы переместить DRGs в новое 35-миллиметровое блюдо культуры, содержащее два миллилитров стерильной коллагеназы типа 1A. Поместите ткань в раствор коллагеназы в инкубатор культуры тканей 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы начать диссоциацию клеток. После инкубации удалите раствор коллагеназы и помойте DRG три раза в два миллилитров сбалансированного соленого раствора Хэнка.
Затем добавьте в блюдо два миллилитров предварительно приготовленного 0,05%трипсина ЭДТА и усваиваете DRG в инкубаторе в течение 30 минут, как и раньше. После пищеварения используйте стеклянную пипетку для переноса двух миллилитров раствора, содержащего DRG, в 15-миллилитровую центрифугу. DRG может придерживаться стеклянной пипетки, так что этот шаг должен быть выполнен с осторожностью.
Фактической потери можно избежать, сохраняя DRG-содержащий раствор в конусном конце стеклянной пипетки, и передачи раствора в центрифугу трубку медленно, но без паузы. Далее центрифуга раствора при 290 градусах G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования, удалить супернатант и добавить еще два миллилитров сыворотки свободной среды для повторного перерасхода DRG.
Повторите мыть дважды, используя два миллилитров довоенной среды культуры, чтобы повторно использовать ткань после окончательной центрифугации. Используйте ранее подготовленные стерильные пламя полированной пипетки вручную тритурировать DRG примерно 60 раз. Затем удалите из инкубатора CO2 поли-L-лизин покрытием 24 хорошо пластины, содержащие один миллилитр культуры среды на колодец.
Аспирировать инкубированную культурную среду из блюда. Семя DRG клеток от одной крысы в четыре скважины. Это дает плотность посева около 500 000 клеток на колодец.
На следующий день замените культурную среду средой, дополненной 10 микромолярной AraC и 100 нанограммами на миллилитр NGF. На третий день после покрытия клеток, изменить средний до 0,5 миллилитров довоенной сыворотки свободной среды, и инкубировать в течение одного часа. Во время инкубации добавьте 50 миллимолярной siRNA в один микролитр воды без RNase до 12,5 микролитров без сыворотки среды на трансфекцию.
Затем пипетка 2,5 микролитров трансфектного реагента в 10 микролитров безотовичной среды для каждой трансфекции. Смешайте оба раствора пипеткой и инкубировать этот смешанный раствор трансфекции в течение 10 минут при комнатной температуре. Через 10 минут добавьте раствор трансфекции в колодцы пластины, содержащей 24 скважины DRG, и аккуратно перемешайте.
После шестичасовой инкубации добавьте 0,5 миллилитров среды культуры с 20%FBS, 10 микромолярной AraC и 100 нанограмм на миллилитр NGF в каждый колодец клеток. Наконец, инкубировать DRG в 37 градусов по Цельсию CO2 инкубатор в течение еще 66 часов. На шестой день после покрытия и через 72 часа после трансфекции siRNA измените культурную среду до 200 микролитров среды, свободной от сыворотки.
После 30-минутной инкубации добавьте один микролитер химического вещества стимуляции и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Здесь используются агонист NPFFR2, dNPA и соответствующий автомобиль. После инкубации в течение необходимого периода, собирать культуру среды из культуры блюдо, и центрифуга в 5000 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы удалить любые приостановленные примеси.
Соберите супернатант из центрифугации и разбавлять фосфатным буфером солевым раствором по мере необходимости. Анализ уровней нейротрансмиттеров с коммерчески доступными наборами ферментного иммуноанализа. В первый день на дно блюда было прикреплено клеточное тело одного нейрона, указанное стрелкой.
Глиальная ячейка, указанная наконечником стрелы, также присутствует. Глиальные клетки дублировали и расширили процессы, чтобы окружить клеточное тело сенсорного нейрона на второй день, процесс, который был еще более заметным на третий день. В другой культуре белок CGRP был окрашен, чтобы выявить форму нейронов.
CGRP окрашивание белка появляется в цитоплазме и аксоны сенсорных нейронов. Ядерные морфологии нейронов и глиальных клеток отличаются, когда окрашены DAPI. Нейроны имеют большее и более округлое ядро, чем глиальные клетки.
Для сравнения, ядра глиальных более овальные по форме. После освоения, этот метод может быть сделано в течение двух с половиной часов, если она выполняется должным образом. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как вскрыть и культуры спинного корня ганглиона, и использовать его в качестве инструмента для расследования основных физиологических функций.
Не забывайте, что работа с первичными клетками может быть гораздо сложнее, чем работа с обычными клеточными линиями, и быть нежным всегда лучший способ при выполнении этих процедур.
