Bu yöntem, periferik nosisepsiyon gibi duyusal araştırma alanında anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu teknik en büyük avantajı en fizyolojik duruma simüle modeli ile duyusal nöronların hücresel mekanizma incelenmesi olduğunu. 2-3 haftalık bir sıçan ın gövdesinden lomber dorsal kök gangliyonu toplayın.
Omurilik kenarları boyunca iki kesik ve lomber omurgarostral ölçüde işaretlemek için bir lateral kesim yaparak başlayın. Sonra, omurganın sırt kaslarını kaldırmak için kemik kesme forceps kullanın. Sonra, omurların sırt kısmını çıkarın ve omuriliği ortaya çıkarın.
Sonra omurilik kaldırmak için diseksiyon makas ve forceps kullanın. Son kaburgadaki omurları sayarak lomber DRG'yi tanımlayın. Bu diyagram omur pozisyonlarını gösterir.
L1'den L6'ya kadar 12 bilateral lomber DRG toplamak için mikro makas kullanın. Kültürün saflığını artırmak için herhangi bir bağlı nöronal lifleri kaldırın. Her lomber DRG'yi iki mililitre buz gibi serumsuz ortam içeren 35 milimetrelik bir kültür yemeğine aktarın. DRG içeren 35 milimetrelik kabı laminar kaputa aktarın ve DRG'yi pipetle üç kez serumsuz orta ile yıkayın.
Steril kollajenaz tip 1A iki mililitre içeren yeni bir 35 milimetre kültür çanak DRGs taşımak için steril cımbız kullanın. Hücrelerin dissociation başlamak için 30 dakika boyunca 37 derece Santigrat doku kültürü kuluçka kollajenaz çözeltisi doku yerleştirin. Kuluçkadan sonra, kollajenaz çözeltisini çıkarın ve DRG'yi Hank'in dengeli tuz çözeltisinin iki mililitresinde üç kez yıkayın.
Daha sonra, çanak için önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin EDTA iki mililitre ekleyin ve daha önce olduğu gibi 30 dakika boyunca kuvözde DRG sindirmek. Sindirimden sonra, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne DRG içeren iki mililitrelik çözeltiyi aktarmak için cam bir pipet kullanın. DRG cam pipete yapışabilir, bu yüzden bu adım özenle yapılmalıdır.
Gerçek kayıp, DRG içeren çözeltiyi cam pipetin konik ucunda tutarak ve çözeltiyi santrifüj tüpüne yavaşça ancak duraksamadan aktararak önlenebilir. Daha sonra çözeltiyi 290 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın ve DRG yeniden askıya almak için serum içermeyen orta başka iki mililitre ekleyin.
Son santrifüjden sonra dokuyu yeniden askıya almak için iki mililitre önceden ısınmış kültür ortamı kullanarak yıkamayı iki kez tekrarlayın. DRG'yi yaklaşık 60 kez manuel olarak triturate etmek için önceden hazırlanmış steril alev cilalı pipetkullanın. Daha sonra, CO2 inkübatörden kuyu başına bir mililitre kültür ortamı içeren poli-L-lizin kaplı 24 kuyu plakasını çıkarın.
Çanak tan kuluçka kültür ortamı aspire. DrG hücrelerini bir sıçandan dört kuyuya tohumla. Bu kuyu başına yaklaşık 500,000 hücre bir tohumlama yoğunluğu verir.
Ertesi gün, 10 mikromolar AraC ve mililitre NGF başına 100 nanogram ile takviye orta ile kültür ortamı değiştirin. Hücre kaplaması sonra gün üç günü, önceden ısıtılmış serum içermeyen orta 0,5 mililitre orta değiştirin ve bir saat kuluçka. Kuluçka sırasında, transfeksiyon başına 12,5 mikrolitre serumsuz ortama bir mikrolitre RNase içermeyen suya 50 milimolar siRNA ekleyin.
Daha sonra pipet 2.5 mikrolitre transfeksiyon reaktifi her transfeksiyon için 10 mikrolitre serumsuz ortama dönüşür. Her iki çözeltiyi de pipetle karıştırın ve bu karışık transfeksiyon çözeltisi oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. 10 dakika sonra, DRG içeren 24 kuyu plaka ve yavaşça sallayarak karıştırın kuyularına transfeksiyon çözeltisi ekleyin.
Altı saatlik kuluçkadan sonra, hücrelerin her kuyuya %20 FBS, 10 mikromolar AraC ve mililitre başına 100 nanogram ngf içeren 0,5 mililitre kültür ortamı ekleyin. Son olarak, DRG'yi 37 derecelik co2 kuluçka makinesinde 66 saat daha kuluçkaya yatırın. Kaplamadan sonraki altıncı günde ve siRNA transfeksiyonundan 72 saat sonra, kültür ortamını 200 mikrolitre serumsuz ortama değiştirin.
30 dakikalık bir kuluçka dan sonra, stimülasyon kimyasal bir mikrolitre ekleyin ve yavaşça pipetleme ile karıştırın. Burada NPFFR2 agonist, dNPA ve ilgili araç kullanılmaktadır. Gerekli süre için kuluçka sonra, kültür çanak kültür ortamı toplamak ve herhangi bir askıya kirleri kaldırmak için dört santigrat derece beş dakika için 5000 kez G santrifüj.
Santrifüjden süpernatant toplayın ve gerektiğinde fosfat tamponlu tuzlu ile seyreltin. Ticari olarak mevcut enzim immünoassay kitleri ile nörotransmitterlerin düzeylerini tsay. İlk gün, okla gösterilen tek bir nöronun hücre gövdesi bir kabın altına iliştirildi.
Bir ok ucu ile gösterilen glial hücre de mevcuttur. Glial hücreler ikinci günde duyusal nöronun hücre vücudunu çevreleyen ve genişletilmiş süreçler, üçüncü günde daha da belirgin bir süreçti. Başka bir kültürde, CGRP protein nöronların şeklini ortaya çıkarmak için lekeli oldu.
CGRP protein boyama duyusal nöronların sitoplazma ve aksonları görünür. Nöronların ve glial hücrelerin nükleer morfolojileri DAPI ile boyandığında farklıdır. Nöronlar glial hücrelerden daha büyük ve daha yuvarlak bir çekirdeğe sahiptir.
Buna karşılık, glial çekirdekleri şeklinde daha oval. Bir kez hakim, bu teknik düzgün yapılırsa iki buçuk saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, dorsal kök ganglion incelemek ve kültür nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalı ve altta yatan fizyolojik fonksiyonları araştırmak için bir araç olarak kullanabilirsiniz.
Birincil hücrelerle çalışmanın normal hücre hatlarıyla çalışmaktan çok daha zor olabileceğini ve nazik olmanın bu yordamı gerçekleştirirken her zaman en iyi yol olduğunu unutmayın.
