この方法は、周辺のノシセプションなどの感覚研究分野の主要な質問に答える上で役立ちます。この技術の主な利点は、生理学的状態に最もシミュレートするモデルを用いて感覚ニューロンの細胞機構を調査することです。2〜3週齢のラットのトランクから腰椎の底根神経節を収集します。
脊柱の側面に沿って2つのカットを行い、腰椎のrostralの範囲をマークするために1つの横切りを行います。次に、骨切断鉗子を使用して背骨の背部筋肉を取り除きます。次に、脊椎の背骨部分を取り除き、脊髄を露出する。
その後、解剖はさみと鉗子を使用して脊髄を取り除きます。最後のリブから椎骨を数えることによって腰部DRGを識別します。この図は、椎骨の位置を示しています。
マイクロハサミを使用して、L1からL6までの12個の両側腰椎DRGを収集します。培養物の純度を向上させるために、付属の神経線維を除去する。各腰椎DRGを2ミリリットルの氷冷血清フリー培地を含む35ミリメートル培養皿に移します。DRG含有35ミリメートル皿を層状フードに移し、ピペットで3回無血清培地でDRGを洗浄します。
滅菌用ピンセットを使用して、2ミリリットルの無菌コラゲナーゼタイプ1Aを含む新しい35ミリメートル培養皿にDRGを移動させます。コラゲナーゼ溶液中に37°Cの組織培養インキュベーターに30分間組織を入れ、細胞の解離を開始する。インキュベーションに続いて、コラゲラーゼ溶液を取り出し、ハンクのバランスのとれた塩溶液の2ミリリットルでDRGを3回洗浄します。
次に、プリウォーム0.05%トリプシンEDTAを2ミリリットル加え、前のようにインキュベーターでDRGを30分間消化します。消化後、ガラスピペットを使用して、DRG含有溶液の2ミリリットルを15ミリリットルの遠心管に移します。DRGはガラスピペットにくっつくかもしれないので、このステップは注意して行われるべきです。
実際の損失は、ガラスピペットのテーパー端にDRG含有溶液を保持し、遠心管にゆっくりと一時停止することなく溶液を移すことによって回避することができます。次に、摂氏4度で5分間Gの290倍の溶液を遠心分離する。遠心分離後、上清を取り除き、さらに2ミリリットルの無血清培地を加えてDRGを再中断します。
洗浄を2回繰り返し、2ミリリットルのプリウォーム培養培地を用いて、最終遠心分離後に組織を再懸濁する。以前に準備した無菌炎研磨ピペットを使用して、DRGを約60回手動でトリチュレートします。次に、CO2インキュベーターから、1ウェルあたり1ミリリットルの培養培地を含むポリL-リジン被覆24ウェルプレートを取り除く。
インキュベートされた培養液を皿から吸引する。1匹のラットから4つの井戸にDRG細胞を播種する。これは、ウェルあたり約500,000細胞の播種密度を与えます。
翌日、培養培地を10マイクロモルアラク、1ミリリットルNGFあたり100ナノグラムを添加した培地に置き換える。細胞めっき後3日目に、培地をプレウォームド無血清培地の0.5ミリリットルに変更し、1時間インキュベートする。インキュベーション中に、RNaseフリー水1マイクロリットルに50ミリモルのsiRNAをトランスフェクションあたり12.5マイクロリットルの無血清培地に添加します。
次いで、トランスフェクション試薬のピペット2.5マイクロリットルを、トランスフェクションごとに10マイクロリットルの無血清培地に入った。両方の溶液をピペットで混合し、この混合トランスフェクション溶液を室温で10分間インキュベートします。10分後、トランスフェクション溶液をDRG含有24ウェルプレートのウェルに加え、軽く振って混ぜます。
6時間のインキュベーションの後、20%FBS、10マイクロモルアラC、および1ミリリットルNGFあたり100ナノグラムの培養培地を細胞の各ウェルに加えます。最後に、DRGを37°CのCO2インキュベーターでさらに66時間インキュベーターでインキュベートします。めっき後6日目、およびsiRNAトランスフェクションの72時間後に、培地を200マイクロリットルの無血清培地に変更する。
30分間のインキュベーションの後、1マイクロリットルの刺激化学物質を加え、ピペットで軽く混ぜます。NPFFR2アゴニスト、dNPAおよび対応する車両がここで使用されます。必要な期間インキュベートした後、培養皿から培養液を回収し、5000倍Gで5分間5分間、摂氏4度で遠心分離機を回収し、懸濁した不純物を除去する。
遠心分離から上清を収集し、必要に応じてリン酸緩衝生理食塩水で希釈します。市販の酵素免疫測定キットを用いて神経伝達物質のレベルをアッセイする。1日目には、矢印で示された単一のニューロンの細胞体が皿の底に取り付けられました。
矢印で示されたグリア細胞も存在する。グリア細胞は、2日目に感覚ニューロンの細胞体を取り囲むプロセスを複製し、拡張し、3日目にさらに顕著であったプロセスである。別の培養において、CGRPタンパク質を染色し、ニューロンの形状を明らかにした。
CGRPタンパク質染色は、感覚ニューロンの細胞質および軸索に現れる。ニューロンとグリア細胞の核形態は、DAPIで染色すると異なります。ニューロンはグリア細胞よりも大きく、より丸みを帯びた核を有する。
対照的に、グリアの核は、より楕円形である。一度習得すると、この技術は、それが正常に実行されている場合、2時間半で行うことができます。このビデオを見た後、あなたは、裏根神経節を解剖し、培養する方法をよく理解し、基礎となる生理機能を調査するためのツールとして使用する必要があります。
プライマリセルを使用することは、通常の細胞ラインで作業するよりもはるかに難しい場合があり、穏やかなことが常にこれらの手順を実行する際に最善の方法であることを忘れないでください。
