近一代测序鉴定小鼠与人体抗体的分泌

在这段视频中，我们描述了一种简单而有效的方法来可视化和分析全球一级的抗体剧目。可以描述个体的整个 B 细胞球状及其对免疫刺激的反应的动态变化。该方法可用于分析新病毒感染患者的病理样本，并获取对感染发病机制前所未有的了解数据。

应用最令人兴奋的领域之一是疫苗控制。通过分析疫苗管理个体中全球抗体的动力学，可以评估疫苗的疗效。个体是新方法的，可能需要优化PCR条件，因为抗体基因扩增的效率取决于起始材料的类型。

用于识别免疫球蛋白的火焰- cher。直观地演示这些操作非常重要。演示这个程序的将是山口小姐和薛汉兵先生，一个技术员和研究生从我实验室。

为了开始这个程序，解剖组织从八个星期大的C57黑色六小鼠，并通过一个不锈钢网与两毫升PBS获得分散的细胞。将电池悬浮液转移到两毫升微离心管中，在 600 倍 g 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。丢弃上流剂，在颗粒中加入800微升的CK lysing缓冲液。

在冰上孵育两分钟，使体内的红血球被杀死。接下来，每次洗涤使用三毫升PBS洗三次组织细胞。在600倍的g和4摄氏度下再次离心5分钟。

丢弃上清液，将800微升酚/瓜尼丁同位素试剂彻底加入颗粒和涡流中。在25摄氏度下孵育5分钟。然后，加入200微升氯仿，手动摇动15秒。

在25摄氏度下孵育两分钟。在12，000倍g和25摄氏度的离心机分离各相。将上水相转移到新鲜管中。

加入一卷70%乙醇。涡流短暂地将这种混合物应用到二氧化硅旋转柱上。用30到100微升水来清洁RNA。

在此之后，使用荧光计对初始RNA浓度进行定量。将净化的RNA储存在零下80摄氏度。首先，根据制造商的说明，使用5'RACE CDS底法和SM SMART-PCR寡核苷酸，从2至10微克的总RNA模板合成第一链cDNA。

对于小鼠免疫球蛋白，PCR使用高保真DNA聚合酶，使用通用正向底原和免疫球蛋白类特异性反向底原，如文本协议中所述，放大cDNA。对于人类免疫球蛋白，使用通用正向底转和具有标记序列的免疫球蛋白类特异性反向素转执行第一个PCR。使用索引序列底转，按第二个 PCR 按每个样本的索引序列。

接下来，电泳的PCR产品在2%的加糖凝胶。在紫外线转光器上可视化DNA波段，并切除含有600至800个碱基对之间的宽带的凝胶片。每10毫克凝胶片加入10微升膜结合溶液。

在 50 至 65 摄氏度下混合和孵育，直到凝胶片完全溶解。然后，将凝胶溶液转移到二氧化硅膜旋转柱上。用洗涤缓冲液洗一次柱，用50微升无核酸水洗脱氧核糖核酸。

使用荧光计，量化纯化的安普利森，并汇集每个免疫球蛋白类的安普利素，以等量进行NGS测序。在此之后，使用基于微胶囊的电泳与DNA尺寸芯片，以确定库的大小和浓度。将库存放在零下 20 摄氏度。

首先，生成一个排序运行的示例电子表格，如文本协议中所述。接下来，解冻试剂盒和库。制作 0.2 氢氧化钠的 0.2 法线溶液，稀释库以获得所需的摩尔浓度。

然后，冲洗和干燥流动细胞，将稀释和变性的库溶液的600微升加入试剂盒的井中，然后开始测序运行。从细胞或组织（如脾脏、骨髓、淋巴结或血液）获得乳氨酸抗体整体的视角。此处显示了来自天真小鼠脾脏的 IgM、IgG1、IgG2c 和免疫球蛋白光链的代表性结果。

在 V（D）J 重新排列 3D V（D）J 绘图中，每个球的大小表示相对读取数。换句话说，它代表整个B细胞中的抗体mRNA的数量。3D网格由110个免疫球蛋白重链V基因、12个免疫球蛋白重链D基因和4个免疫球蛋白重链J基因组成，这些基因对齐以反映它们在染色体上的顺序。

2D VJ 图显示了 IGL 剧目中 VJ 重新排列的轮廓。每个条形的长度表示读取的相对数量。X轴代表101个免疫球蛋白光链V-kappa基因，3个免疫球蛋白光链V-lambda基因，Y轴代表4个免疫球蛋白光链J-kappa基因，以及3个免疫球蛋白光链J-lambda基因。

从包括外周血单核细胞或病理组织在内的各种组织可以分析人体抗体整体的视角。此处显示了来自正常外周血单核细胞的IgM、总IgG、总IgA、IgD、IgE和IgL的代表性结果。与 murine 模型一样，V（D）J 重新排列的剧目配置文件显示在 3D V（D）J 绘图上，其中每个球的大小表示相对读取数。

3D网格由56个免疫球蛋白重链V基因、27个免疫球蛋白重链D基因和6个免疫球蛋白重链J基因组成，按它们出现在染色体上的顺序排列。IgL 剧目中 VJ 重新排列的轮廓在 2D VJ 图中描述，其中每个条形的长度表示相对读取数。X轴代表41个免疫球蛋白光链V-kappa基因，32个免疫球蛋白光链V-lambda基因，Y轴代表5个免疫球蛋白光链J-kappa基因，5个免疫球蛋白光链J-lambda基因。

在该协议的研究材料中，少量按流式细胞仪甚至病理样本的低温分拣细胞是可用的。但是，需要仔细优化 PCR 条件。由于该协议的输出信息是巨大的，生物信息学素养将有助于找到抗体网络的结构。

这将导致对免疫系统的深入理解。